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1、实验十一组织培养与病毒的细胞感染法练习内容1鸡胚纤维母细胞培养法（示教）2病毒的空斑形成试验（示教）3致细胞病变作用的观察（示教）目的要求1了解细胞培养的原理与方法2了解病毒空斑形成试验方法与意义3了解病毒对细胞致病变作用的类型。一、单层细胞培养法（一）鸡胚纤维母细胞培养法（二）人胚肾细胞培养法二、人双倍体细胞培养法双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而直保持其双倍染色体的单层细胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾三、传代细胞培养法传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双倍体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如He
2、la细胞，KB细胞、HEP2细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮四、器官培养五、病毒的细胞感染法在单层细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验.六、细胞致病作用的观察细胞致病作用也称“细胞病变作用”（Cytopathic-effect，CPE），根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。（一）全变型指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。（二）包涵体型有的病毒可在胞核
3、或胞浆内形成包涵体（见表133）。（三）融合型有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈“巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。【结果观察】纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度：（）无细胞病变；（+）25以下的细胞有病变作用；（+）一50的细胞有病变作用；（+）一75左右的细胞有病变作用；（+）一75以上的细胞有病变作用；某些病毒引起细胞病变的主要特征(表132)实验十四病毒的血清学试验血清学试验的方法很多，一股实验室最常用的是中和试验，补体结合试验和红细胞凝集及凝集抑制试验。近年来免疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接红细胞凝集试验、琼脂扩散试验以及红细胞吸
4、附抑制试验等技术，也成为实验室病毒诊断的常规技术。练习内容1病毒的血球凝集试验2病毒的血球撬集抑制试验目的要求1了解病毒的血清学试验方法与原理2掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、
5、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点.这里我们以新鸡城瘟病毒NDV为例介绍血凝和血凝抑制试验。【材料】新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液1份0.5鸡血球悬液1管生理盐水或PBS1瓶96孔微量血清盘1块微量稀释棒1支无菌试管1支【方法】1在微量血清盘的末孔标记为对照孔。2各孔中加生理盐水25微升。3取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即110稀释）。4取110病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸25微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次依次稀释，直至第9孔弃去25微升。5各孔中加0.5鸡红血球25微升充分摇匀。6置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。
6、以45分钟为准。新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5)2525252525252525孔列12345678910病毒稀释度1101201401801160132016401128012560对照生理盐水（l）2525110病毒悬液（l）252525252525252525弃去250.5%鸡红血球（l）25252525252525252525摇匀后，置室温静止3050分钟【结果判读】各孔出现的血球凝集程度以+、+、+、+、+、表示。+为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底；+约有50血球发生凝集；+约有50血球发生凝集；+约有25血球发生凝集；不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘
7、光滑，圆润。血凝试验的结果以50血球凝集（+）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为1个血凝单位。血球凝集抑制试验【材料】除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。【方法】1血凝素单位的配制和调配2住微量血清盘上编号，并设血清对照、病毒（血凝集）对照和血球对照孔然后211孔中各加生理盐水或PBS25微升。3将110血清加入1、2、9孔，并从第2孔起作一系列倍比稀释至11280或更高的稀释度，每孔为25微升。4按操作简表加入4单位血凝集。6混匀，在室温下作用20分钟。7各孔中滴加0.596鸡血血球悬液50微升。8在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球对照孔中滴加生理盐水或PBS各25微升。9混匀
8、后，在室温下静止，30分钟，60分钟各观察一次结果。一般以60分钟结果为准，但如果血球下滑显著，则以30分钟结果判读。252525252525251234567891011血清稀释度11012014018011601320164011280血清对照病毒对照血球对照生理盐水（l）NS2550稀释的血清（l）252525252525252525弃去4单位血凝（l）252525252525252525摇匀后，置室温静止3050分钟0.5%鸡红血球（l）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.51根据各孔血球凝集程度，以“+、+、+、+，”表示。2查看各对照孔：血清对照不凝集（
9、）：病毒对照为完全凝集（+），血球对照则应不凝集（）。3以出现完全抑制血球凝集（即不凝集）的最高血清稀释度为其最终滴度。例如稀释倍数：110 l20 140 l80 1160 1320l64011280结果：+此血清血凝抑制滴度为1160，结果判读】实验十五病毒的快速诊断目的要求1初步掌握电镜下病毒的基本形态2了解ELISA的原理、方法及结果判读练习ELISA酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedimmunosorbentassay，ELISA）ELISA是当前各实验检测抗原抗体最常用的方法之一，也是进行病毒快速诊断的重要手段。它具有灵敏度高（109一1012克），特异性强、操作简便、易于
10、观察、便于现场大规模检查。ELISA的种类有许多种，但用于病毒快速诊断常用间接法和双抗体夹心法（一）间接法（indirectmethod）1抗原包被纯化抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加100微升，置湿盒中4过液，洗涤三次。2加待捡血清每孔加100微升适当稀释的待检血清，置湿盒中，372小时。洗涤三次。3加酶结合物每孔加100微升酶标记抗人Ig，置湿盒中，372小时。洗涤三次。4加底物每孔加底物100微升，置湿盒，3730分钟。6加终止液100微升。6读取结果。（二）双抗体夹心法（Doubleantibodysandwichmethod）1抗体包被已知抗体用pH9.
11、6碳酸盐缓冲液稀释至110微克毫升，在微量凹孔板上，每孔加100微升包被，置湿盒4过夜。洗涤三次。2加待检标本每孔中加含抗原的待检标本100微升置湿盒37小时。洗涤三次。3加酶结合物每孔加酶标记的特异性抗体100微升置湿盒37小时。洗涤三次。4加底物5加终止液6读取结果【结果判读】用酶标测定仪测在492nm下各标本光密度OD值。ELISA的结果易受到各种因素影响，因此每次试验（每一块试验板）都设阳性对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对照OD值1.0，阴性对照OD值0.2，结果用PN值表示。P/N值1.5-2.1者为可疑PN值1.5为阴性PN值2.1者为阳性谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH