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1、外源基因的表达检测及遗传特性第1 页，本讲稿共54 页第一章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达第二节 DNA 序列对转化外源基因表达的调控第三节 DNA 甲基化对转化外源基因表达的调控第四节 提高转化外源基因表达的策略第2 页，本讲稿共54 页第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达一、转化外源基因的瞬时表达 在合适的条件下，转化的外源基因通常在数小时后就能检测到其表达的产物，并在1-2 天内达到最高值，随后又逐渐降低，至十多天后完全消失。这种短时间内的外源基因表达称之为瞬时表达。第3 页，本讲稿共54 页1.外源基因瞬时表达的机制（1）瞬时表达是未整
2、合的外源基因的表达（2）瞬时表达是一种正常的表达方式 基因扩增是指细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象。扩增的基因片断游离在细胞核内。第4 页，本讲稿共54 页2.外源基因瞬时表达的影响因素（1）质粒DNA 的基因结构；（2）细胞内源核酸酶的影响；（3）受体细胞生理状态及其内源Gus 酶抑 制剂的影响；第5 页，本讲稿共54 页3.外源基因瞬时表达的应用（1）在基因转化研究中的应用农杆菌转化能力的检测；优化基因转化条件，选择导入DNA 的方法，确定农杆菌共培养的时间等。（2）植物基因表达调控的研究启动子、增强子、内含子、终止子的功能研究；外界因素对基因表达调控的影响；植物激素的调控
3、机理。第6 页，本讲稿共54 页二、转化外源基因的稳定表达 所谓稳定表达是指外源基因整合到和基因组DNA 分子上，并能稳定地遗传的外源基因的表达。需符合以下条件：（1）表达时间长，无迅速衰退现象；（2）DNA 已整合到植物基因组中；（3）能够传递给后代，并符合分离规律。第7 页，本讲稿共54 页第二节 DNA序列对转化外源基因表达的调控一、植物基因工程中常用的启动子按作用方式及功能不同可将启动子分为三类：1.组成型启动子2.组织特异性启动子3.诱导型启动子第8 页，本讲稿共54 页1.组成型启动子 在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部为表达水平也没有明显差异，
4、为此称之为非特异性表达组成型启动子。其特点是：表达具持续性；表达量相对稳定；不表现时空特异性；不受外界因素诱导；在结构上存在六聚体花纹序列（TGACTG），往往以重复形式出现并被6-8个核苷酸隔开。第9 页，本讲稿共54 页（1）CaMV35S 启动子 该启动子来自花椰菜花叶病毒（CaMV），其转录产物的沉降系数为35S，故名。最近发现35S 启动子可以划分为两个区域：从-90+8为A 区域，主要负责在胚根、胚乳的根及根组织内表达；从-343-90 为B 区域，主要负责在胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达，在B 区域内的增强子序列可以提高表达水平。第10 页，本讲稿共54 页（2）No
5、s 和Oct 启动子 来自与根癌农杆菌Ti 质粒的胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因，具有与植物基因相似的序列。第11 页，本讲稿共54 页2.组织特异性启动子 也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子等。第1
6、2 页，本讲稿共54 页3.诱导型启动子 所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动子等。第13 页，本讲稿共54 页二、终止子的转录调控作用 不同来源的有着很大影响。使用35S启动子与NPTII 结构基因形成共整合体，并于不同来源的终止子构建成融合基因，转化烟草。发现不同的终止子使NPTII 基因的表达水平可相差60 倍。植物基因的终止密码子多用UGA，而在双子叶植物中，UAA 的使用频率高于UGA。第14 页，本讲稿共54
7、 页三、5，3 端序列对外源基因转录后的调控作用 基因的整体表达过程包括：转录、初级转录产物的加工、运输、mRNA 的翻译以及蛋白产物的后加工这一系列步骤，每个步骤上都存在着复杂而精细的调节，只提高外源基因的转录活性并不能有效地提高细胞中相应的mRNA 水水平和蛋白含量。分析和改造转录产物的结构、提高mRNA 的稳定性和翻译活性是转录后调控研究的重点。第15 页，本讲稿共54 页1.5 端帽序列的调控 帽子结构不仅能提高翻译起始频率，还能保护mRNA 免遭外且核酸酶的破坏，提高mRNA 的稳定性。第16 页，本讲稿共54 页2.5 端先导序列的调控 从真核基因mRNA 5 端帽子到起始密码子之
8、间的不翻译核苷酸序列称为先导序列。先导序列的结构、组成和长度对翻译效率的影响是存在的，但不是绝对的。TMV 基因组RNA68 碱基的先导序列和AMV RNA436 碱基的先导序列具有提高外源基因mRNA 翻译活性的功能。第17 页，本讲稿共54 页3.poly(A)及其信号序列的调控 poly(A)和某些蛋白因子的结合能保护mRNA 免遭外切核酸酶的降解。3 端聚腺苷酸信号附近的一些核苷酸序列能够促进提高植物基因表达水平，很可能是通过促进mRNA 加工和增加其稳定性而发挥作用。第18 页，本讲稿共54 页四、内含子对转化外源基因的表达调控作用1.内含子有利于基因的变异进化（1）有利于在内含子序
9、列之间发生重组，从而产生新的基因；（2）内含子切割点的变异导致外显子延伸。2.内含子具有提高外源基因表达水平的作用 由于内含子的有效拼接提高了细胞中成熟mRNA 的水平，从而有利于基因表达。第19 页，本讲稿共54 页五、信号肽序列对转化外源基 因翻译产物的调控作用 翻译的完成不是基因表达的结束，初级翻译产物并不具有生物活性，称之为前体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白质的运输和分泌有关。第20 页，本讲稿共54 页第三节 甲基化对转化外源基因的表达调控 DNA 甲基化现象广泛地存在于动植物细胞中，有许多重要的生物学功能，
10、包括DNA 复制起始、突变、修饰限制系统等。通过改变DNA 的甲基化状态可以调控基因的表达。第21 页，本讲稿共54 页1.DNA 甲基化的作用机制（1）甲基化影响DNA 与蛋白质的相互识别与作用；（2）甲基化影响DNA 的构象，从而调节DNA的基因活性。如以5-氮胞嘧啶核苷取代胞苷，诱导消除甲基化修饰，可使基因激活。第22 页，本讲稿共54 页2.DNA 甲基化在转基因植物中的作用 众多实验表明，DNA 甲基化严重影响外源基因在转基因植物中的表达水平。第23 页，本讲稿共54 页第四节 提高转化外源基因表达的策略一、克服转化外源基因失活的策略1.筛选单拷贝转基因株系；2.核基质附着区的使用；
11、3.诱导型表达启动子的使用；4.基因DNA 序列的改造。二、启动子、增强子、终止子、内含子、5 和3 端调控序列的使用三、优化先导序列，提高翻译效率第24 页，本讲稿共54 页第二章 外源基因整合的鉴定 为获得真正的转基因植株，进行基因转化后要进行以下工作：第一步：筛选转化细胞；第二步：对转化植株进行分子生物学鉴定，Southern、Northern、Western。第三步：性状鉴定；第四步：遗传学分析，获得转基因品种。第25 页，本讲稿共54 页第一节 Southern 杂交 Southern 杂交用于检测和分析外源基因的整合情况。用标记的外源基因（或片断）做探针，与植物细胞染色体DNA 进
12、行杂交。具体的检测方法有Southern 斑点杂交和Southern 印迹杂交两种。下面以Southern 印迹杂交为例加以介绍。第26 页，本讲稿共54 页一、植物总DNA 提取1.植物总DNA 提取提取原理及方法概述2.植物总DNA 提取的实验设计3.植物DNA 样品纯度及浓度的检测4.植物DNA 样品的保存第27 页，本讲稿共54 页1.植物总DNA 提取原理及方法概述（1）CTAB 法原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，从溶
13、液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶于乙醇。第28 页，本讲稿共54 页方法：1.取1-50 克新鲜植物材料，于液氮中研磨成粉。2.将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积（w/v）65 预热的2 x CTAB 提取缓冲液，充分混匀，65 保温10-20 分钟，其间不时摇动。3.加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下12000rpm 离心10-20 分钟。4.将上清转入另一离心管中，假如1/10 体积的10%CTAB，混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心
14、管混匀，室温下12000rpm 离心10-20 分钟。5.取上相，重复4 操作一次。第29 页，本讲稿共54 页6.将上相转入新的离心管，加入1-1.5 倍体积的1x CTAB 沉淀缓冲液，混匀，室温下放置30 分钟，沉淀。7.3500-4000rpm 离心5-10 分钟，去上清，沉淀吹干。8.按0.5ml/g 材料的比例加入1mol/L 乙酸铵溶液，使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L 乙酸铵至终浓度为2.5mol/L.9.加入2 倍体积的异戊醇，混匀，室温下放置10 分钟。10.10000rpm 离心5 分钟，去上清。11.用70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量TE。优点：能很好的去除
15、糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。第30 页，本讲稿共54 页（2）SDS 法原理：利用高浓度的SDS，在较高温度（55-65）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5mol/L 的KAC 于冰上保温，低温条件下KAC 与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清中的DNA 反复用酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。第31 页，本讲稿共54 页（3）植物总DNA 提取时常遇到的问题1.植物材料中含有较多的多酚类物质，使DNA 呈褐色。解决办法：提高CTAB 提取缓冲液中巯基乙醇的含量或在SD
16、S 提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。2.植物细胞壁难以破碎。解决办法：在SDS 提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷冻条件下研磨。第32 页，本讲稿共54 页2.植物DNA 样品纯度及浓度的鉴定 用于Southern 杂交的植物DNA 样品在纯度、长度及浓度上均有较高的要求。纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限制性内切酶活性的物质；在长度上不应低于50kb；浓度应在0.5-1 g/l 之间。目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。第33 页，本讲稿共54 页（1）琼脂糖凝胶电泳 1.所提植物DNA 应呈现出一条分子量较大的清晰条带。如样品呈弥散状，说明DNA 已严重降解，可
17、能原因是：所用的器皿及试剂是否灭菌；材料收集后是否立即冷冻，研碎过程中或研碎后进入提取液前是否融化；是否有剧烈振动、吸管口过窄、产生起泡、反复吹打等操作。2.如在溴酚兰处出现明亮的荧光区，说明RNA 过多，可用RNA 酶消化。3.如在样品槽内有荧光出现，说明DNA 为完全溶解或浓度过高，或样品不纯。4.估算样品的浓度。第34 页，本讲稿共54 页（）紫外分光光度法测定1.纯度：纯净的DNA 溶液其OD260OD280应为1.8，OD260OD230应大于2.0。如果OD260OD280大于1.8，表明应中含有较多的RNA；如果OD260OD280小于1.6，则说明样品中蛋白质较多；OD260O
18、D230小于2.0 时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质，可增加70%乙醇洗涤沉淀的次数。2.浓度：DNA 样品浓度（g/l）=OD260 稀释倍数0.05第35 页，本讲稿共54 页二、杂交探针的制备 探针是指经特殊化和物标记的特定的核苷酸序列。用于检测植物基因组中外源基因整合的探针应为同源探针，一般长度在300bp 以上。杂交探针的制备包括探针核苷酸序列的获取和标记两部分内容。第36 页，本讲稿共54 页1.探针核苷酸序列的获取（1）人工合成；（2）从质粒上切取（质粒DNA 的制备 质粒DNA 样品纯度及浓度的检测 质粒DNA 的酶切 探针片断的回收）。第37 页，本讲稿共54 页2.探
19、针标记（1）标记物理想的标记物应满足以下条件：1.标记前后探针的基本结构和性质相同；2.检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操作简便、节时；3.稳定、安全、无环境污染；4.经济。第38 页，本讲稿共54 页表一、标记物类别放射性标记物放射性标记物生物素类 酶类 半抗原 荧光素 其他3H14C32P33P125I131I35S生物素光敏生物素碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶地高辛配基异硫氰酸荧光素、罗达明、四甲基异硫氰酸汞离子、AAF、AAIF、金、银第39 页，本讲稿共54 页（2）标记方法1.切口平移法2.随机引物法3.末端标记法4.化学标记法第40 页，本讲稿共54 页1.切口平移法 利用
20、微量的DNA 酶I 使待标记的双链DNA 分子产生若干单链缺口，然后E.coliDNA 聚合酶I 的5 3 外切作用在切口的5 端将脱氧核苷酸逐个切下，同时该酶的3 5 聚合或性诱使反应体系中的核苷酸底物按模板要求依次连接到切口的3 羟基处。第41 页，本讲稿共54 页2.随机引物法 随机引物法是近几年来兴起的一种有效的标记方法，在反应体系中加入寡核苷酸引物，模板DNA 变性成单链后与寡核苷酸引物杂交，形成局部的双链区，DNA 聚合酶以引物的3-OH 为起始点，按照模板的顺序形成互补的探针。该方法有如下优点：要求模板纯度不是很高；反应比较稳定；标记的探针比活性高；可在低溶点琼脂糖中反应。第42
21、 页，本讲稿共54 页3.末端标记法 5 末端标记常用T4 多聚核苷酸激酶，标记物常用-32PATP。3 末端标记常用末端转移酶，该酶催化-32PdNTP 加到3 末端。第43 页，本讲稿共54 页4.化学标记法 酶法是先将标记物标记在核苷酸上，然后再通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某个基团发生化学反应而进行标记。酶法目前使用较多，但标记程序复杂，费用高；化学法的主要问题是试剂及操作因标记物不同而不同，没有一个常规的方法。第44 页，本讲稿共54 页三、Southern 印迹杂交1.Southern 印迹杂交原理2.Southern
22、印迹杂交的实验样品3.Southern 印迹杂交的实验程序第45 页，本讲稿共54 页1.Southern 印迹杂交原理 将被检植株的基因组DNA 提取出来，用限制性内切酶酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片断按分子大小依次排布在凝胶上。用碱处理凝胶，使个酶切片端在凝胶上原位变性，利用印迹技术将变性的各酶切片端由凝胶转移到固相膜上，经烘干或紫外照射处理，使印迹的各片断与固相膜牢固结合。经预杂交处理，掩盖膜上的非特异杂交位点后，将膜放入含有单链探针的杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。膜上与探针同源的单链序列可以通过碱基互补作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应位置上。最后根据探针的标记性质进行检
23、出。第46 页，本讲稿共54 页2.Southern 印迹杂交的实验样品 Southern 印迹杂交鉴定外源基因整合要准备以下样品：（1）阳性对照样品：含外源基因的质粒。（2）阴性对照样品：非转化植株总DNA。（3）分子量标准：（4）被检样品：待检转化植株总DNA。第47 页，本讲稿共54 页3.Southern 印迹杂交的实验程序（1）植物总DNA 的限制性酶切；（2）凝胶电泳分离各酶切片段；（3）各酶切片段于凝胶中原位变性；（4）将凝胶中变性的DNA 片段转移到固相膜上；（5）预杂交，掩盖非特异性位点；（6）杂交；（7）漂洗去除未结合的及非特异结合的探针；（8）杂交体检出。第48 页，本讲稿共54 页第二节 其他检测技术1.PCR2.PCR-Southern3.RFLP 和RAPD第49 页，本讲稿共54 页第三章 外源基因表达的检测第50 页，本讲稿共54 页第51 页，本讲稿共54 页第52 页，本讲稿共54 页第53 页，本讲稿共54 页第54 页，本讲稿共54 页