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1、会计学1荧光法测定药片中维生素荧光法测定药片中维生素B含量含量荧光分光光度法测定药片中维生素荧光分光光度法测定药片中维生素B B2 2的含量的含量实验目的实验目的实验目的实验目的学习荧光分光光度法测定药片中维生学习荧光分光光度法测定药片中维生学习荧光分光光度法测定药片中维生学习荧光分光光度法测定药片中维生素素素素B B2 2的分析原理。的分析原理。的分析原理。的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测掌握荧光分光光度计的操作技术和测掌握荧光分光光度计的操作技术和测掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素定药片中维生素定药片中维生素定药片中维生素B B22的方法。的方法。的方法。的方法。
2、掌握掌握掌握掌握OriginOrigin绘图软件的使用方法绘图软件的使用方法绘图软件的使用方法绘图软件的使用方法第1页/共26页实验原理实验原理实验原理实验原理荧光分析法荧光分析法 常常常常温温温温下下下下，处处处处于于于于基基基基态态态态的的的的分分分分子子子子吸吸吸吸收收收收一一一一定定定定的的的的紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见光光光光的的的的辐辐辐辐射射射射能能能能成成成成为为为为激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子，激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子通通通通过过过过无无无无辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁至至至至第第第第一一一一激激激激发发发发态态态态的的的的最最最最低低低
3、低振振振振动动动动能能能能级级级级，再再再再以以以以辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁的的的的形形形形式式式式回回回回到到到到基基基基态态态态，发发发发出出出出比比比比吸吸吸吸收收收收光光光光波波波波长长长长长长长长的的的的光光光光而而而而产产产产生生生生荧光。荧光。荧光。荧光。第2页/共26页实验原理实验原理实验原理实验原理荧光分析法荧光分析法 在在在在稀稀稀稀溶溶溶溶液液液液中中中中，荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度I IF F与与与与物物物物质质质质的的的的浓浓浓浓度度度度c c有有有有以以以以下下下下的的的的关系：关系：关系：关系：当当当当实实实实验验验验条条条条件件件件一一一一定定定定
4、时时时时，荧荧荧荧光光光光强强强强度度度度与与与与荧荧荧荧光光光光物物物物质质质质的的的的浓浓浓浓度成线性关系：度成线性关系：度成线性关系：度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。第3页/共26页a.a.与紫外与紫外与紫外与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更可见分光度法比较，荧光分析法具有更可见分光度法比较，荧光分析法具有更可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。高的灵敏度。高的灵敏度。高的灵敏度。b.b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依选择性好。荧光法既能依据发射
5、光谱，又能依选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。据吸收光谱来鉴定物质。据吸收光谱来鉴定物质。据吸收光谱来鉴定物质。c.c.所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。荧光分析法的特点荧光分析法的特点第4页/共26页激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长)，化合，化合，化合，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光物发射的荧光强度与激发光波长的关系
6、曲线。激发光物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。最大。最大。最大。荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱第5页/共26页发射光谱：固定激发光波长发射光谱：固定激发光波长发射光谱：固定激发光波长发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长选最大激发波长选最大激发波长选最大激发波长),),化化化化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线
7、。合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固固固固定定定定发发发发射射射射光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出出最最最最大大大大激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长，然然然然后后后后固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长进进进进行行行行荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长扫扫扫扫描描描描，找找找找出出出出最最最最大大大大荧荧荧荧光光光光发发发发射射射射波波波波长长长长。激激激激发发发发光光光光波波波波长长长
8、长和和和和发发发发射射射射荧荧荧荧光波长的选择是本实验的关键。光波长的选择是本实验的关键。光波长的选择是本实验的关键。光波长的选择是本实验的关键。荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱第6页/共26页荧光分析仪器荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：液槽显
9、示器单色器检测器I0IIf光源单色器第7页/共26页荧光分析仪荧光分析仪器器 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；的影响；的影响；的影响；b.b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较荧光
10、分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。好的激发光并消除其它杂散光干扰。好的激发光并消除其它杂散光干扰。好的激发光并消除其它杂散光干扰。第8页/共26页a.a.光光光光源源源源：在在在在荧荧荧荧光光光光计计计计中中中中常常常常用用用用卤卤卤卤钨钨钨钨灯灯灯灯作作作作光光光光源源源源；荧荧荧荧光光光光分分分分度度度度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.b.单单单单色色色色器器器器：荧荧荧荧光光光光计计计计的的的的单单单单色色色色器器器器是是是是滤滤滤滤光光光光片片片片，只
11、只只只能能能能用用用用于于于于定定定定量量量量分分分分析析析析；荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计采采采采用用用用两两两两个个个个光光光光栅栅栅栅单单单单色色色色器器器器，可获得激发光谱和荧光光谱。可获得激发光谱和荧光光谱。可获得激发光谱和荧光光谱。可获得激发光谱和荧光光谱。c.c.检检检检测测测测器器器器：荧荧荧荧光光光光计计计计采采采采用用用用光光光光电电电电管管管管作作作作检检检检测测测测器器器器；荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光度计采用光电倍增管作检测器。光度计采用光电倍增管作检测器。光度计采用光电倍增管作检测器。光度计采用光电倍增管作检测器。仪器部件仪器部件仪
12、器部件仪器部件第9页/共26页维生素维生素维生素维生素B B2 2（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，VBVB2 2）是橘黄色无臭的针状）是橘黄色无臭的针状）是橘黄色无臭的针状）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：结晶，其结构式为：结晶，其结构式为：结晶，其结构式为：维生素维生素维生素维生素B B2 2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
13、性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。药液维生素药液维生素药液维生素药液维生素B B B B2 2 2 2含量的测定含量的测定含量的测定含量的测定第10页/共26页 维维维维生生生生素素素素B B2 2溶溶溶溶液液液液在在在在430430480480nmnm蓝蓝蓝蓝光光光光的的的的照照照照射射射射下下下下，发发发发出出出出绿绿绿绿色色色色荧荧荧荧光光光光，其其其其峰峰峰峰值值值值波波波波长长长长为为为为525525nmnm。VBVB2 2的的的的荧荧荧荧光光光光在在在在pH=6pH=67 7时时时时最最最最强强强强，在在在在pH=11pH=11时时时时消消消消失失失失。维维维维生生生生素素素素B
14、 B2 2在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中经经经经光光光光线线线线照照照照射射射射会会会会发发发发生生生生分分分分解解解解而而而而转转转转化化化化为为为为光光光光黄黄黄黄素素素素，光光光光黄黄黄黄素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光比比比比核核核核黄黄黄黄素素素素的的的的荧荧荧荧光光光光强强强强的的的的多多多多，故故故故测测测测VBVB2 2的的的的荧荧荧荧光光光光时时时时溶溶溶溶液液液液要要要要控控控控制制制制在在在在酸酸酸酸性性性性范范范范围围围围内内内内，且且且且在在在在避避避避光光光光条条条条件件件件下下下下进行。进行。进行。进行。第11页/共26页光黄素光黄素光黄素光黄素
15、第12页/共26页实验预习实验预习实验预习实验预习vv预预预预习习习习荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度法法法法测测测测定定定定维维维维生生生生素素素素B B2 2的的的的分分分分析析析析原原原原理。理。理。理。vv了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B B22的方法。的方法。的方法。的方法。第13页/共26页F-4500F-4500型荧光光度计（日本日立公司）型荧光光度计（日本日立公司）型荧光光度计（日本日立公司）型荧光光度计（日本日立公司）10mL10mL具赛试管具赛试
16、管具赛试管具赛试管1010只，移液枪只，移液枪只，移液枪只，移液枪1 1只，只，只，只，100mL100mL容量瓶容量瓶容量瓶容量瓶2 2只只只只5 51010-5-5gmLgmL-1-1VBVB2 2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙标准溶液（置阴暗处保存），冰乙标准溶液（置阴暗处保存），冰乙标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（酸（酸（酸（ARAR），），），），药用药用药用药用VBVB2 2试样试样试样试样(510-4gmL-1510-4gmL-1)仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂第14页/共26页1.1.打开计算机，先接通电源开关（打开计算机，先接通电源开关（打开计算机，先接通电源开关
17、（打开计算机，先接通电源开关（POWERPOWER），），），），5 5秒钟秒钟秒钟秒钟后再按下后再按下后再按下后再按下XeLAMPXeLAMP按钮，再接通主开关（按钮，再接通主开关（按钮，再接通主开关（按钮，再接通主开关（MAINMAIN），此），此），此），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。软件。软件。软件。2.2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，仪器初始化完毕后，在工作
18、界面上选择测量项目，仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.3.样品测定。样品测定。样品测定。样品测定。4.4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。关机顺序：逆开机顺序实施操作。关机顺序：逆开机顺序实施操作。关机顺序：逆开机顺序实施操作。基本操作基本操作基本操作基本操作第15页/共26页1.1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：标准系列溶
19、液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在在在在1010个干净的个干净的个干净的个干净的10mL10mL具赛试管中，分别吸取具赛试管中，分别吸取具赛试管中，分别吸取具赛试管中，分别吸取2525、5050、7575，100100、125125、150150、175175、200uLVB200uLVB2 2标准溶液，标准溶液，标准溶液，标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。标准溶液的荧光强度。标准溶液的荧光强度。标准溶液的荧光强度
20、。实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤第16页/共26页2.2.未知试样的测定未知试样的测定未知试样的测定未知试样的测定:在两支在两支在两支在两支10mL10mL具赛试管中，分别移取具赛试管中，分别移取具赛试管中，分别移取具赛试管中，分别移取100uL100uL试样试样试样试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。相同的条件，测量其荧光强度。相同的条件，测量其荧光强度。相同的条件，测量其荧光强度。实验步骤实验步骤实验步骤实验
21、步骤第17页/共26页1.1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中上求得其浓度，计算出试样中上求得其浓度，计算出试样中上求得其浓度，计算出试样中VBVB2 2含量。含量。含量。含量。数据处理数据处理数据处理数据处理第18页/共26页1.1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高
22、的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.2.维维维维生生生生素素素素B B2 2在在在在pHpH6 67 7时时时时荧荧荧荧光光光光最最最最强强强强，本本本本实实实实验验验验为为为为何何何何在酸性溶液中测定？在酸性溶液中测定？在酸性溶液中测定？在酸性溶液中测定？注意事项和问题注意事项和问题注意事项和问题注意事项和问题第19页/共26页1 1、波长扫描（波长扫描（波长扫描（波长扫描（WavelengthScanWavelengthScan）对样品进行对样品进行对样品进行对样品进行激发波长或发射波长的
23、扫描。激发波长或发射波长的扫描。激发波长或发射波长的扫描。激发波长或发射波长的扫描。点击快捷栏点击快捷栏点击快捷栏点击快捷栏“Method”,Method”,显示出显示出显示出显示出“AnalysisAnalysisMethod”Method”的五个命令，分别为的五个命令，分别为的五个命令，分别为的五个命令，分别为 General(General(常规常规常规常规)、Instrument(Instrument(仪器条件仪器条件仪器条件仪器条件)、Monitor(Monitor(模拟监测模拟监测模拟监测模拟监测)、processing(processing(处理方法处理方法处理方法处理方法)、R
24、eport(Report(报告格式报告格式报告格式报告格式)，输入相，输入相，输入相，输入相应数据。应数据。应数据。应数据。附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明第20页/共26页1.1GeneralMeasurement-1.1GeneralMeasurement-选择选择选择选择WavelengthWavelength1.2Instrument1.2InstrumentScanmode-Scanmode-输入扫描方式输入扫描方式输入扫描方式输入扫描方式Datamode-Datamode-输入数据采集方式输入数据采集方式输入数
25、据采集方式输入数据采集方式EMWL-EMWL-输入发射波长输入发射波长输入发射波长输入发射波长EXStartWL-EXStartWL-输入激发起始波长输入激发起始波长输入激发起始波长输入激发起始波长EXEndWL-EXEndWL-输入激发终止波长输入激发终止波长输入激发终止波长输入激发终止波长EXWL-EXWL-输入激发波长输入激发波长输入激发波长输入激发波长EMStartWL-EMStartWL-输入发射起始波长输入发射起始波长输入发射起始波长输入发射起始波长EMEndWL-EMEndWL-输入发射终止波长输入发射终止波长输入发射终止波长输入发射终止波长附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操
26、作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明第21页/共26页Scanspeed-Scanspeed-扫描速度选择扫描速度选择扫描速度选择扫描速度选择 Delay-Delay-延迟时间延迟时间延迟时间延迟时间 EXSlit-EXSlit-激发单元狭缝激发单元狭缝激发单元狭缝激发单元狭缝 EMSlit-EMSlit-发射单元狭缝发射单元狭缝发射单元狭缝发射单元狭缝 PMTVoltage-PMTVoltage-光电管负高压光电管负高压光电管负高压光电管负高压 Response-Response-响应速度响应速度响应速度响应速度 Correctedspectra-Correct
27、edspectra-光谱校正光谱校正光谱校正光谱校正 Shuttercontrol-Shuttercontrol-光闸控制光闸控制光闸控制光闸控制 Replicates-Replicates-重复次数重复次数重复次数重复次数 Cycletime-Cycletime-循环周期循环周期循环周期循环周期附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明第22页/共26页1.3MonitorY-AxisMax-1.3MonitorY-AxisMax-纵轴标尺上限值纵轴标尺上限值纵轴标尺上限值纵轴标尺上限值Y-AxisMin-Y-AxisMin-纵轴
28、标尺下限值纵轴标尺下限值纵轴标尺下限值纵轴标尺下限值2 2、时间扫描（、时间扫描（、时间扫描（、时间扫描（TimeScanTimeScan）此扫描方式是此扫描方式是此扫描方式是此扫描方式是EX,EMEX,EM的波的波的波的波长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。2.1GeneralMeasur
29、ement-2.1GeneralMeasurement-选择选择选择选择TimeScanTimeScan2.2Instrument2.2InstrumentDatamode-Datamode-数据采集方式数据采集方式数据采集方式数据采集方式 EXWL-EXWL-设定激发波长设定激发波长设定激发波长设定激发波长 EMWL-EMWL-设定发射波长设定发射波长设定发射波长设定发射波长Timeunit-Timeunit-时间单位时间单位时间单位时间单位Scantime-Scantime-扫描周期扫描周期扫描周期扫描周期附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：
30、仪器操作软件有关说明第23页/共26页2.32.3其它与波长扫描相同，从略。其它与波长扫描相同，从略。其它与波长扫描相同，从略。其它与波长扫描相同，从略。3 3、光度法（、光度法（、光度法（、光度法（PhotometryPhotometry）也称工作曲线法，是定也称工作曲线法，是定也称工作曲线法，是定也称工作曲线法，是定量测量方法。有六个子命令，分别为量测量方法。有六个子命令，分别为量测量方法。有六个子命令，分别为量测量方法。有六个子命令，分别为GeneralGeneral、QuantitationQuantitation、InstrumentInstrument、StandardsStand
31、ards、MonitorMonitor、Report,Report,输入相应测量条件后进行测量。输入相应测量条件后进行测量。输入相应测量条件后进行测量。输入相应测量条件后进行测量。3.1General3.1GeneralMeasurement-Measurement-选择选择选择选择PhotometryPhotometry附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明第24页/共26页3.2Quantitation3.2QuantitationQuantitationtype-Quantitationtype-选测量类型选测量类型选测量
32、类型选测量类型Calibrationtype-Calibrationtype-校正曲线类型校正曲线类型校正曲线类型校正曲线类型3.3Instrument3.3Instrument3.4standards3.4standards4 4、三维扫描、三维扫描、三维扫描、三维扫描（3-DSCAN3-DSCAN）当某个样品不知最佳当某个样品不知最佳当某个样品不知最佳当某个样品不知最佳激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动快速地给出最佳条件。快速地给出最佳条件。快速地给出最佳条件。快速地给出最佳条件。4.1General-4.1General-选择选择选择选择3-DScan3-DScan方式。方式。方式。方式。4.24.2其它子命令选择方式同前。其它子命令选择方式同前。其它子命令选择方式同前。其它子命令选择方式同前。附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明附录：仪器操作软件有关说明第25页/共26页