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1、会计学1河南师范大学河南师范大学 细胞细胞(xbo)生物学生物学第一页，共83页。内容提要内容提要(ni rn t yo)n n细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法n n细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法n n细胞培养、细胞工程和显微操作技术细胞培养、细胞工程和显微操作技术n n细胞生物学研究的模式细胞生物学研究的模式(msh)生物生物第1页/共82页第二页，共83页。第一节第一节 细胞形态结构的观察细胞形态结构的观察(gunch)方法方法n n显微镜的出现，结合细胞化学显微镜的出现，结合细胞化学(huxu)的方的方法，尤其是免疫细胞化学法，尤其是免疫细胞化学(huxu)技术，技术，
2、细胞整体形态、细胞的结构、细胞中的分细胞整体形态、细胞的结构、细胞中的分子甚至原子都得以揭示。子甚至原子都得以揭示。第2页/共82页第三页，共83页。Figure 3-1.Resolving power.Sizesofcellsandtheircomponentsdrawnonalogarithmicscale,indicatingtherangeofobjectsthatcanbereadilyresolvedbythenakedeyeandinthelightandelectronmicroscopes.第3页/共82页第四页，共83页。一、光学一、光学(gungxu)显微镜技术：显微镜技
3、术：n n光学显微镜技术是细胞生物学研究常用手段之光学显微镜技术是细胞生物学研究常用手段之一。一。n n光学显微镜构成：光学显微镜构成：n n 光学放大系统（包括物镜和目镜）光学放大系统（包括物镜和目镜）n n 照明照明(zhomng)系统系统n n 支撑系统支撑系统第4页/共82页第五页，共83页。1 复式光学复式光学(gungxu)显微显微镜技术镜技术第5页/共82页第六页，共83页。uu显微镜最为重要的性能参数是分辨率（指显微镜最为重要的性能参数是分辨率（指区分开两个质点间的最小距离），而非放区分开两个质点间的最小距离），而非放大倍数大倍数(bish)。uu性能参数：分辨率性能参数：分辨
4、率(D值值)越小，分辨率越高越小，分辨率越高uu（D值与光源波长值与光源波长成正比，与介质折射率成正比，与介质折射率N成反比；成反比；所以波长越短，分辨率越高，所以波长越短，分辨率越高，介质折射率越大，分辨率越高）介质折射率越大，分辨率越高）uu 0.61uu N sin（/2）D=第6页/共82页第七页，共83页。n n以波长以波长(bchng)最短的可见光（最短的可见光（400-700nm）的蓝光（）的蓝光（450nm）为光源，空气为）为光源，空气为折射介质，光学显微镜最大分辨率折射介质，光学显微镜最大分辨率0.3um；以油为折射介质，可以达到以油为折射介质，可以达到0.2um；如果以；如
5、果以紫外线（紫外线（200-300nm）作为光源，分辨率可）作为光源，分辨率可达到达到0.1um。n n 光镜下可以看到的结构包括细菌、线粒体光镜下可以看到的结构包括细菌、线粒体（0.5um大小，是光镜下能清晰可见的最小大小，是光镜下能清晰可见的最小物体）、中心体、核仁等，称为显微结构。物体）、中心体、核仁等，称为显微结构。第7页/共82页第八页，共83页。组织组织(zzh)切片的制备切片的制备固定的目的是使细胞固定的目的是使细胞(xbo)及其成分锁定在原有的位置，及其成分锁定在原有的位置，常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀
6、绿、苏丹黑、常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、考马斯亮蓝等，它们对细胞某一特殊的亚细胞成分考马斯亮蓝等，它们对细胞某一特殊的亚细胞成分有特异的亲和性。有特异的亲和性。切片厚度切片厚度1-10um第8页/共82页第九页，共83页。第9页/共82页第十页，共83页。n n使用明视野显微镜（使用明视野显微镜（bright-field microscope）很难观察到小的、未经染色的）很难观察到小的、未经染色的样品，如：活细胞。样品，如：活细胞。n n相差显微镜（相差显微镜（phase-contrast microscope）则）则易于观察高透明易于观察高透明(tumng)的物体。的物体。第
7、10页/共82页第十一页，共83页。2 相差相差(xin ch)和微分干涉显和微分干涉显微镜技术微镜技术相差显微镜：相差显微镜：利用光的衍射现象，通过增加相差版和环形利用光的衍射现象，通过增加相差版和环形光阑，将肉眼不能察觉的相位差转变成振光阑，将肉眼不能察觉的相位差转变成振幅差，从而表现为肉眼可见的明暗幅差，从而表现为肉眼可见的明暗(mn n)区别。区别。样品不需要染色，优点是能观察无色、透明样品不需要染色，优点是能观察无色、透明的活细胞中的结构。利用的是不同成分、的活细胞中的结构。利用的是不同成分、部分的光衍射系数不同的特点。部分的光衍射系数不同的特点。细胞培养中使用的倒置相差显微镜，更便
8、于细胞培养中使用的倒置相差显微镜，更便于观察培养物中的活细胞。观察培养物中的活细胞。第11页/共82页第十二页，共83页。微分干涉微分干涉(gnsh)显微镜：显微镜：利用光的干涉利用光的干涉(gnsh)现象，以平面偏振光现象，以平面偏振光为光源，适合观察活细胞中较大的细胞器。为光源，适合观察活细胞中较大的细胞器。与录像装置结合，可以观察和记录活细胞中与录像装置结合，可以观察和记录活细胞中颗粒及细胞器的运动，例如：录像增差显颗粒及细胞器的运动，例如：录像增差显微镜技术（微镜技术（video-enhance contrast microscopy）就是将计算机辅助系统应用于）就是将计算机辅助系统应
9、用于微分干涉微分干涉(gnsh)显微镜，可以观察微管显微镜，可以观察微管上颗粒的运动。上颗粒的运动。第12页/共82页第十三页，共83页。Figure 3-11.Four types of light microscopy.(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-field microscopy.(B)phase-contrastmicroscopy,(C)Nomarskidifferential-interfere
10、nce-contrastmicroscopy,and(D)dark-fieldmicroscopy（暗视野显微镜）.第13页/共82页第十四页，共83页。Video-enhance(contrast)microscopyvObserving living specimens;vGreatly increase the contrast of an image so that very small objects become visible.第14页/共82页第十五页，共83页。3 荧光荧光(ynggung)显微镜技术显微镜技术荧光显微镜的原理是利用一定波长的紫外线荧光显微镜的原理是利用一定波
11、长的紫外线作为光源来激发标本中存在的荧光物质，作为光源来激发标本中存在的荧光物质，使其发出不同颜色的光而成像。是目前光使其发出不同颜色的光而成像。是目前光镜水平对蛋白等大分子定性定位研究镜水平对蛋白等大分子定性定位研究(ynji)的重要工具。的重要工具。包括两套滤光片，激发光滤片（只让能激发包括两套滤光片，激发光滤片（只让能激发特殊荧光染料的波长通过）和阻断滤片特殊荧光染料的波长通过）和阻断滤片（只允许荧光通过），在黑暗的背景上，（只允许荧光通过），在黑暗的背景上，发出荧光的样品很容易被观察到。发出荧光的样品很容易被观察到。第15页/共82页第十六页，共83页。第16页/共82页第十七页，共8
12、3页。n有些生物体中的天然物质受到紫外线照射能够有些生物体中的天然物质受到紫外线照射能够发出荧光，有些成分则不发光或荧光微弱发出荧光，有些成分则不发光或荧光微弱(wiru)，需要特定的荧光染料染色显示。，需要特定的荧光染料染色显示。n常用荧光染料：常用荧光染料：n DAPI(联脒基苯吲哚联脒基苯吲哚)和碘化丙锭可以染和碘化丙锭可以染DNA；n 吖啶橙可以染吖啶橙可以染DNA和和RNA；n 荧光黄（荧光黄（fluorescein）受到蓝光激发产生强）受到蓝光激发产生强烈的绿色荧光；罗丹明（烈的绿色荧光；罗丹明（rhodamine）受到黄）受到黄绿色光激发可产生深红色荧光，分别与抗体耦绿色光激发可
13、产生深红色荧光，分别与抗体耦联，可以观察两种不同抗原分子在同一细胞内联，可以观察两种不同抗原分子在同一细胞内的分布。的分布。第17页/共82页第十八页，共83页。Figure 3-9.Fluorescence microscopy.MicrographsofaportionofthesurfaceofanearlyDrosophilaembryoinwhichthemicrotubuleshavebeenlabeledwithanantibodycoupledtofluorescein(left panel)andtheactinfilamentshavebeenlabeledwithanan
14、tibodycoupledtorhodamine(middle panel).Inaddition,thechromosomeshavebeenlabeledwithathirddyethatfluorescesonlywhenitbindstoDNA(right panel).Atthisstage,allthenucleioftheembryoshareacommoncytoplasm,andtheyareinthemetaphasestageofmitosis.Thethreemicrographsweretakenofthesameregionofafixedembryousingth
15、reedifferentfiltersetsinthefluorescencemicroscope.第18页/共82页第十九页，共83页。n n在细胞生物学与分子生物学领域在细胞生物学与分子生物学领域(ln y)中，中，来自水母的绿色荧光蛋白基因常被用作为一来自水母的绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报告基因个报告基因(reporter gene)。n n将将GFP基因与待测基因融合，在细胞内表达，基因与待测基因融合，在细胞内表达，可以通过荧光显微镜观察蛋白在活细胞内动可以通过荧光显微镜观察蛋白在活细胞内动态变化。态变化。第19页/共82页第二十页，共83页。日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲
16、和美籍华裔(huy)科学家钱永健因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获得2008年诺贝尔化学奖。第20页/共82页第二十一页，共83页。4 激光激光(jgung)扫描共焦显微镜扫描共焦显微镜技术技术n n20世纪世纪(shj)50年代后期发明，多技术的集年代后期发明，多技术的集合。合。n n物镜和聚光镜同时聚焦到同一点上（共焦点）物镜和聚光镜同时聚焦到同一点上（共焦点），可以自动改变观察的焦平面，通过，可以自动改变观察的焦平面，通过“光学光学切片切片”获得一系列细胞不同切面上的图像，获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后重构样品的三维结构。经叠加后重构样品的三维结构。n n比普通荧光显微
17、镜成像更清晰，分辨率更高。比普通荧光显微镜成像更清晰，分辨率更高。n n在研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化在研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化应用广泛。应用广泛。第21页/共82页第二十二页，共83页。Figure 3-8.Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilamen
18、ts.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.第22页/共82页第二十三页，共83页。5 荧光共振荧光共振(gngzhn)能量转移能量转移技术技术n n检测活细胞中生物大分子纳米级距离和纳米级检
19、测活细胞中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有利工具，可以检测两个蛋白质距离变化的有利工具，可以检测两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。分子是否存在直接的相互作用。n n方法是将两种蛋白分别与方法是将两种蛋白分别与CFP（cyan fluorescent protein）,YFP（yellow fluorescent protein）融合表达，通过检测）融合表达，通过检测CFP荧光强度荧光强度的损失量确定两个蛋白是否相互作用。如果的损失量确定两个蛋白是否相互作用。如果发生能量转移，说明两个蛋白的距离在发生能量转移，说明两个蛋白的距离在10nm的范围的范围(fnwi)内，一般可以认定有相互
20、作内，一般可以认定有相互作用。用。第23页/共82页第二十四页，共83页。6 荧光漂白恢复荧光漂白恢复(huf)技术技术n n利用荧光分子的耦联，检测活细胞表面或内利用荧光分子的耦联，检测活细胞表面或内部的分子运动以及部的分子运动以及(yj)在各种结构上分在各种结构上分子动态变化率的大小。子动态变化率的大小。n n能够获得蛋白质运动的定性结果，还可以得能够获得蛋白质运动的定性结果，还可以得到扩散常数、蛋白移动率等定量信息。到扩散常数、蛋白移动率等定量信息。n n 图图3-10第24页/共82页第二十五页，共83页。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)n n分辨率更高，分辨率更高，19
21、32年年Ruska制成。制成。n n与光镜的基本区别：与光镜的基本区别：n n构成上：光源为电子束（小于构成上：光源为电子束（小于0.1nm），使），使用电磁透镜，镜筒中要求高真空，图像通用电磁透镜，镜筒中要求高真空，图像通过荧光屏观察。过荧光屏观察。n n分辨率上：最高分辨率上：最高0.2nm，只能，只能(zh nn)在在电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结构（超微结构）。构（超微结构）。第25页/共82页第二十六页，共83页。n n透射透射(tu sh)电子显微镜（电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）n
22、n 利用透过样品的电子形成图像，在观察细利用透过样品的电子形成图像，在观察细胞内部结构方面应用广泛。胞内部结构方面应用广泛。n n扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）n n 利用样品表面反弹的电子成像，主要用于利用样品表面反弹的电子成像，主要用于观察物体的表面结构。观察物体的表面结构。第26页/共82页第二十七页，共83页。1 透射电子显微镜透射电子显微镜 放大倍数在放大倍数在1000-250000倍之间，分辨极限倍之间，分辨极限为为35埃。埃。TEM电镜制样技术：电镜制样技术：(1)超薄切片超薄切片(qi pin)技术技术:厚度厚
23、度40-50nm 固定固定包埋包埋切片切片(qi pin)染色染色第27页/共82页第二十八页，共83页。第28页/共82页第二十九页，共83页。Figure 3-19.Diagram of the copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope.Thin sections第29页/共82页第三十页，共83页。Figure 3-20.Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmi
24、um and other heavy metal ions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.第30页/共82页第三十一页，共83页。Figure 3-21.Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme(nucleotide diphosphatase)in the Golgi apparatus.Athinsection
25、ofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitateuponreactionwiththeenzyme第31页/共82页第三十二页，共83页。Figure 3-63.Immunogold electron microscopy.Electronmicrographsofaninsulin-secretingcellinwhichtheinsulinmoleculeshavebeenlabeledwithanti-insulinantibodiesboundtotinycolloidalgoldspher
26、es.Mostoftheinsulinisstoredinthedensecoresofsecretoryvesicles;inaddition,somecoresarebeingdegradedinlysosomes.第32页/共82页第三十三页，共83页。(2)冷冻超薄切片技术冷冻超薄切片技术可以保存可溶性物质和生物大分子的活性可以保存可溶性物质和生物大分子的活性（尤其是酶），能够在分子水平上研究细（尤其是酶），能够在分子水平上研究细胞的超薄结构。胞的超薄结构。样品放置在液态丙烷（样品放置在液态丙烷（-42）或液氦（）或液氦（-273 ）冷却的金属块上，快速冷冻，冰晶没）冷却的金属块上，快
27、速冷冻，冰晶没有时间生长到明显破坏细胞结构的程度。有时间生长到明显破坏细胞结构的程度。冷冻切片制备快速，在临床上用于切除组织冷冻切片制备快速，在临床上用于切除组织的恶性的恶性(xng)或良性的鉴定。或良性的鉴定。第33页/共82页第三十四页，共83页。(3)冷冻蚀刻电镜技术冷冻蚀刻电镜技术 通过样品迅速冷冻和低温下断裂，观察通过样品迅速冷冻和低温下断裂，观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构(jigu)。样品可不经包埋和固定处理。样品可不经包埋和固定处理。第34页/共82页第三十五页，共83页。Figure.Freeze-fracture electron mic
28、rograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell.Thesemembranes,whichcarryoutphotosynthesis,arestackedupinmultiplelayers.ThelargestparticlesseeninthemembranearethecompletephotosystemII-acomplexofmultipleproteins.Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy 第35页/共82页第三十六
29、页，共83页。Figure 3-22.Three-dimensional reconstruction from serial sections.Singlethinsectionssometimesgivemisleadingimpressions.Inthisexamplemostsectionsthroughacellcontainingabranchedmitochondrionwillappeartocontaintwoorthreeseparatemitochondria.Sections4and7,moreover,mightbeinterpretedasshowingamito
30、-chondrionintheprocessofdividing.Thetruethree-dimensionalshape,however,canbereconstructedfromserialsections.系列系列(xli)切片的三维重构切片的三维重构第36页/共82页第三十七页，共83页。2 扫描电子显微镜：扫描电子显微镜：主要观察样品表面的形貌特征。主要观察样品表面的形貌特征。制样不需要切片和染色。制样不需要切片和染色。为防止样品在干燥中变形，常用为防止样品在干燥中变形，常用CO2临界点临界点干燥法，样品观察前要用镀金（一般是金干燥法，样品观察前要用镀金（一般是金或金或金-钯合金
31、）的方法使标本导电。钯合金）的方法使标本导电。观察样品的大小范围观察样品的大小范围(fnwi)从病毒到昆虫从病毒到昆虫的头部，一般放大为的头部，一般放大为15-150000倍，分辨率倍，分辨率3nm。第37页/共82页第三十八页，共83页。Figure 3-23.Scanning electron microscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydiffere
32、ntial-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).第38页/共82页第三十九页，共83页。Figure 3-32.Cells in culture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.第39页/共82页第四十页，共83页。3 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜 （scanning tunnel microscpoe,STM）1986年获诺贝尔
33、物理学奖，用于观察大年获诺贝尔物理学奖，用于观察大分子、生物膜和病毒等，在纳米水平探分子、生物膜和病毒等，在纳米水平探索微观世界物质索微观世界物质(wzh)表面形貌。表面形貌。第40页/共82页第四十一页，共83页。第二节第二节 细胞细胞(xbo)组分的分析组分的分析方法方法1 细胞的分离技术：分离特定类型细胞细胞的分离技术：分离特定类型细胞2 亚细胞组分的分离技术：分离特定的细胞器亚细胞组分的分离技术：分离特定的细胞器或组分或组分3 细胞化学技术：显示鉴定大分子细胞化学技术：显示鉴定大分子4 免疫细胞化学技术：特异蛋白的定位和定性免疫细胞化学技术：特异蛋白的定位和定性5 原位杂交技术：特定核
34、酸原位杂交技术：特定核酸(h sun)序列的定序列的定位和定性位和定性6 放射自显影技术：标记的生物大分子定位、放射自显影技术：标记的生物大分子定位、定量以及大分子动态示踪定量以及大分子动态示踪第41页/共82页第四十二页，共83页。1 细胞的分离细胞的分离(fnl)技术：技术：（1）流式细胞技术（）流式细胞技术（flow cytometer,FCM）：）：从组织中分选相对纯化细胞的方法，利用从组织中分选相对纯化细胞的方法，利用了荧光了荧光(ynggung)染料耦联的抗体标记细胞，染料耦联的抗体标记细胞，通过通过FCM分选已标记和未标记的细胞，依据分选已标记和未标记的细胞，依据的是细胞内发荧光
35、的是细胞内发荧光(ynggung)的的DNA含量不含量不同，或者细胞表面荧光同，或者细胞表面荧光(ynggung)强度不同强度不同的特点。的特点。该技术广泛用于生物大分子的定量，细胞该技术广泛用于生物大分子的定量，细胞周期分析，细胞表面抗原、受体、染色体、核周期分析，细胞表面抗原、受体、染色体、核质比例、活细胞分类纯化等研究中。质比例、活细胞分类纯化等研究中。第42页/共82页第四十三页，共83页。Figure 3-31.A fluorescence-activated cell sorter.Whenacellpassesthroughthelaserbeam,itismonitoredfo
36、rfluorescence.Dropletscontainingsinglecellsaregivenanegativeorpositivecharge,dependingonwhetherthecellisfluorescentornot.Thedropletsarethendeflectedbyanelectricfieldintocollectiontubesaccordingtotheircharge.Notethatthecellconcentrationmustbeadjustedsothatmostdropletscontainnocellsandflowtoawastecont
37、ainertogetherwithanycellclumps.Thesameapparatuscanalsobeusedtoseparatefluorescentlylabeledchromosomesfromoneanother,providingvaluablestartingmaterialfortheisolationandmappingofgenes.第43页/共82页第四十四页，共83页。2 细胞淘洗（细胞淘洗（elutration）分离细胞：）分离细胞：将细胞悬浮在淘洗分离室，细胞受到方向将细胞悬浮在淘洗分离室，细胞受到方向相反的两种力的作用，细胞在分离室中的沉相反的两种力的作用
38、，细胞在分离室中的沉积位置取决于沉降速率积位置取决于沉降速率(sl)（与细胞大小、（与细胞大小、形状和密度有关）。形状和密度有关）。该方法的特点是分离速度快，同时可以分该方法的特点是分离速度快，同时可以分离不同周期和不同时相的细胞，可用于细胞离不同周期和不同时相的细胞，可用于细胞周期、细胞增殖的研究。周期、细胞增殖的研究。3 密度梯度离心法分离细胞：密度梯度离心法分离细胞：通过离心溶液形成密度梯度，以维持重力通过离心溶液形成密度梯度，以维持重力的稳定性来抑制对流。的稳定性来抑制对流。第44页/共82页第四十五页，共83页。2 亚细胞组分亚细胞组分(zfn)的分离技术：的分离技术：n n通常是用
39、低渗、超声、研磨、匀浆或冻融的方通常是用低渗、超声、研磨、匀浆或冻融的方法将细胞裂解，然后通过差速离心法将细胞裂解，然后通过差速离心(lxn)（differential centrifugation）使各种）使各种亚组分分开。亚组分分开。n n不同组分的沉降率依据大小和形状的不同，以不同组分的沉降率依据大小和形状的不同，以沉降系数沉降系数(S)表示。表示。n n通过密度梯度离心通过密度梯度离心(lxn)，可以将分子量小，可以将分子量小的核酸或蛋白质进一步分离纯化出来。例如：的核酸或蛋白质进一步分离纯化出来。例如：15N标记大肠杆菌标记大肠杆菌DNA，用氯化铯密度梯度离，用氯化铯密度梯度离心心(
40、lxn)的方法直接证明了的方法直接证明了DNA的半保留复的半保留复制。制。第45页/共82页第四十六页，共83页。The technique of differential centrifugationStep-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x=110-13sec.第46页/共82页第四十七页，共83页。第47页/共82页第四十八页，共83页。Figure 3-35.Cell fractionation by centrifugatio
41、n.Repeatedcentrifugationatprogressivelyhigherspeedswillfractionatehomogenatesofcellsintotheircomponents.Ingeneral,thesmallerthesubcellularcomponent,thegreateristhecentrifugalforcerequiredtosedimentit.Typicalvaluesforthevariouscentrifugationstepsreferredtointhefigurearelowspeed:1,000timesgravityfor10
42、minutesmediumspeed:20,000timesgravityfor20minuteshighspeed:80,000timesgravityfor1hourveryhighspeed:150,000timesgravityfor3hours第48页/共82页第四十九页，共83页。3 细胞化学细胞化学(huxu)技术技术n n基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相结合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色结合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色沉淀物或结合物而显示细胞的结构和成分。沉淀物或结合物而显示细胞的结构和成分。n nDNA的显示：的显
43、示：Feulgen反应反应n n多糖的显示：过碘酸雪夫（多糖的显示：过碘酸雪夫（PAS）反应）反应n n脂类的显示：四氧化锇或苏丹脂类的显示：四氧化锇或苏丹IIIn n酶的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻酶的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻(lngdng)切片，切片，尽可能保持其活性，然后尽可能保持其活性，然后将样品与相应底物进行共孵育。不同的酶有不将样品与相应底物进行共孵育。不同的酶有不同的显示方法。同的显示方法。第49页/共82页第五十页，共83页。4 免疫免疫(miny)细胞化学技术细胞化学技术n n在细胞水平研究特定的蛋白质的定位和定性，在细胞水平研究特定的蛋白质的定位和定性，利用抗体
44、的抗原特异性识别利用抗体的抗原特异性识别(shbi)结合细胞结合细胞内特定的蛋白质，再通过第二抗体的结合，使内特定的蛋白质，再通过第二抗体的结合，使信号加强。信号加强。n n最为敏感的增强信号的方法是用结合于第二抗最为敏感的增强信号的方法是用结合于第二抗体的酶作为标记分子。例如：荧光染料用于荧体的酶作为标记分子。例如：荧光染料用于荧光显微镜、辣根过氧化物酶用于光镜或电镜、光显微镜、辣根过氧化物酶用于光镜或电镜、胶体金颗粒用于电镜、碱性磷酸酶用于生化检胶体金颗粒用于电镜、碱性磷酸酶用于生化检测。测。n n常用的有免疫荧光技术、免疫电镜技术，临床常用的有免疫荧光技术、免疫电镜技术，临床上的利用酶联
45、免疫吸附试验（上的利用酶联免疫吸附试验（ELISA）的敏感）的敏感性可以检测妊娠或各种感染。性可以检测妊娠或各种感染。第50页/共82页第五十一页，共83页。Figure 3-64.Indirect immunocytochemistry.Themethodisverysensitivebecausetheprimaryantibodyisitselfrecognizedbymanymoleculesofthesecondaryantibody.Thesecondaryantibodyiscovalentlycoupledtoamarkermoleculethatmakesitreadilyd
46、etectable.Commonlyusedmarkermoleculesincludefluoresceinorrhodaminedyes,theenzymehorseradishperoxidaseorcolloidalgoldspheres,andtheenzymesalkalinephosphataseorperoxidase.第51页/共82页第五十二页，共83页。Figure 3-57.Visualizing intracellular Ca2+concentrations using a fluorescent indicator.Thebranchingtreeofdendri
47、tesofthePurkinjecellinthecerebellumreceivesmorethan100,000synapsesfromotherneurons.Theoutputfromthecellisconveyedalongthesingleaxonseenleavingthecellbodyatthebottomofthepicture.ThisimageoftheintracellularcalciumconcentrationinasinglePurkinjecellwastakenusingalow-lightcameraandtheCa2+-sensitivefluore
48、scentindictorfura-2.TheconcentrationoffreeCa2+isrepresentedbydifferentcolors,redbeingthehighestandbluethelowest.(CourtesyofD.W.Tanketal.)第52页/共82页第五十三页，共83页。Figure 3-58.Fluorescent analogue cytochemistry.Fluorescencemicrographoftheleadingedgeofalivingfibroblastthathasbeeninjectedwithrhodamine-labele
49、dtubulin.Themicrotubulesthroughoutthecellhaveincorporatedthelabeledtubulinmolecules.Thusindividualmicrotubulescanbedetectedandtheirdynamicbehaviorfollowedusingcomputer-enhancedimaging,asshownhere.Althoughthemicrotubulesappeartobeabout0.25mthick,thisisanopticaleffect;theyare,inreality,onlyone-tenthth
50、isdiameter.(CourtesyofP.SammehandG.Borisy.)第53页/共82页第五十四页，共83页。5 原位杂交技术原位杂交技术(jsh)n n原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）是采用标记）是采用标记的核酸探针通过分子杂交确定的核酸探针通过分子杂交确定(qudng)特异特异核苷酸序列在染色体或细胞中位置的方法。核苷酸序列在染色体或细胞中位置的方法。n n首先在光镜水平上发展起来，又出现了荧光首先在光镜水平上发展起来，又出现了荧光原位杂交（荧光素标记探针在荧光显微镜下原位杂交（荧光素标记探针在荧光显微镜下观察）、电镜原位杂交（生物素等小分子