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1、第七章第七章 体液蛋白质检验体液蛋白质检验本章内容概要本章内容概要第一节第一节 概述概述第二节第二节 血清总蛋白测定血清总蛋白测定第三节第三节 血清清蛋白测定血清清蛋白测定第四季第四季 血浆纤维蛋白原测定血浆纤维蛋白原测定第五节第五节 血清粘蛋白测定血清粘蛋白测定第六节第六节 其他体液蛋白质测定其他体液蛋白质测定第七节第七节 血清蛋白电泳分析血清蛋白电泳分析本章教学要求掌握 血清总蛋白测定、血清清蛋白测定、醋酸纤维素薄膜电泳测定血清蛋白熟悉 血浆蛋白质的测定方法及评价、血浆纤维蛋白原测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定血清蛋白了解 血浆蛋白质的生理功能、血清粘蛋白测定、其他体液蛋白质测定第一节第一节
2、概述概述p机体蛋白质机体蛋白质：p体液蛋白质的检测：体液蛋白质的检测：机体主要的机体主要的 生物大分子生物大分子含量：人体固体成分的含量：人体固体成分的45%种类：种类：10万，万，30005000种种/单细胞单细胞功能：生长，代谢、血凝、运动、免功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等疫、信息传递等疾病发生疾病发生体液蛋白质体液蛋白质异常异常要判断异常要判断异常首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能及分类及特点一、血浆蛋白质的组成、功能及分类一、血浆蛋白质的组成、功能及分类n组成：组成：种类：种类：1000种种 500种种 200种种含量：
3、含量：g mg g来源：肝脏是蛋白质主要的加工来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂厂n功能：功能：（1）营养作用，修补组织蛋白，供能；）营养作用，修补组织蛋白，供能；（2）维持血浆胶体渗透压：）维持血浆胶体渗透压：白蛋白维持白蛋白维持75%80%的血浆渗透压，作用的血浆渗透压，作用是促使组织液回流入血，维持血管内外的水平衡；是促使组织液回流入血，维持血管内外的水平衡；（3）运输作用：）运输作用：作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；载体；（4）作为）作为PH缓冲系统的一部分：缓冲系统的一部分：酸性或碱性蛋白质，血浆酸性或碱性蛋白质，血浆
4、PH7.35-7.45；（5）体液免疫防御系统：）体液免疫防御系统：作为免疫球蛋白与补体等免疫分子；作为免疫球蛋白与补体等免疫分子；（6）参与凝血与纤维蛋白溶解；）参与凝血与纤维蛋白溶解；除除因子外均可因子外均可（7）催化作用：）催化作用：酶的本质；酶的本质；（8）其他生理功能：）其他生理功能：代谢调控作用，作为底物，酶或中间产物抑制或激代谢调控作用，作为底物，酶或中间产物抑制或激活组织蛋白酶活组织蛋白酶n分类：分类：依据依据来源来源、分离方法分离方法和和生理功能生理功能来源来源肝生成：肝生成：绝大多数血浆蛋白质绝大多数血浆蛋白质其他组织细胞生成：其他组织细胞生成：免疫球蛋白免疫球蛋白和和蛋白
5、类激素蛋白类激素分离方法分离方法盐析法：白蛋白盐析法：白蛋白/球蛋白球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）半饱和的硫酸铵溶液）电泳法：电泳法：醋酸纤维素薄膜电泳：醋酸纤维素薄膜电泳：6种种琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：13种种聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种种SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种种分分辨辨率率增增高高-+纤维蛋白原纤维蛋白原醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜二、血浆蛋白质的测定方法及评价n测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质测定依据：蛋白质测定一般利用蛋白质以下的结构或性质1 1、元素组成测定：、元素组成测定：含含N N
6、稳定；稳定；2 2、重复的肽链结构：、重复的肽链结构：具有多个肽键；具有多个肽键；3 3、酪氨酸和色氨酸与、酪氨酸和色氨酸与FolinFolin-酚试剂反应酚试剂反应显色显色或或UV UV 吸收；吸收；4 4、与色素结合的能力：、与色素结合的能力：与染料以离子键或共价键连接；与染料以离子键或共价键连接；5 5、沉淀后借浊度测定：、沉淀后借浊度测定：光度计测定；光度计测定；6 6、光折射测定：、光折射测定：折射仪测定。折射仪测定。方法方法 化学法化学法 凯氏定氮法凯氏定氮法参考方法，参考方法，双缩脲法双缩脲法(推荐推荐)，酚，酚试剂法，比浊法试剂法，比浊法 物理法物理法 电泳法、紫外分光光度法电
7、泳法、紫外分光光度法 染料结合法染料结合法 免疫化学法免疫化学法根据蛋白质平均含氮量根据蛋白质平均含氮量16%计算蛋白浓度计算蛋白浓度凯氏定氮法参考标准方法凯氏定氮法参考标准方法(0.05mg N 0.3g pro)消化消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）蒸馏蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；吸收吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使HH+）滴定滴定用已标定的无机酸滴用已标定的无机酸滴（使（使H+恢复），恢复），计算总氮量计算总氮量定蛋白定蛋白（总氮量总氮量-非蛋白氮）非蛋白氮）6.25
8、=6.25=蛋白含量蛋白含量n原理：原理：n评价：评价：优点：准确度高，精密度优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参高，灵敏度高，是公认的参考方法。考方法。缺点：操作复杂，费时，缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是白含氮量会有所变化尤其是疾病时。疾病时。n应用：应用：标准蛋白的标定标准蛋白的标定及校正其它常规方法及校正其它常规方法（参（参考方法）考方法）双缩脲法双缩脲法n原理：原理：蛋白质中的肽键蛋白质中的肽键（-CONH-CONH-）在在碱性碱性溶液中能与溶液中能与Cu2+作用而产生作用而产生紫红色络合物紫红色络合物，其颜色的
9、深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件：至少含两个肽键（条件：至少含两个肽键（-CONH-CONH-）基团才能和）基团才能和CuCu2+2+形成络合物形成络合物,氨基酸及二肽无反氨基酸及二肽无反 应应,三肽以上才能反应。三肽以上才能反应。双缩脲生成 加热加热NH322H180022222N 端端C 端端n评价：评价：优点：简便，准确，重复性好，优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L10g-120g/L线性好，线性好，特异性与精密度好，批内特异性与精密度好，批内CV%CV%2%2%，显色稳
10、定。，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。合。n应用：应用：常规推荐方法。手工或上机使用。常规推荐方法。手工或上机使用。酚试剂法酚试剂法n原理：原理：蛋白质分子中的蛋白质分子中的酪氨酸残基酪氨酸残基和和色氨酸残基色氨酸残基能够和能够和酚试剂酚试剂中的中的磷钨酸磷钨酸-磷钼酸磷钼酸反应生成蓝色化合物，反应生成蓝色化合物，LowryLowry改良法：改良法：在在酚试剂中加入酚试剂中加入CuCu2+2+（75%75%呈色），提高了呈色），提高了呈色的灵敏度，为呈色的灵敏度，为双缩脲法的双缩脲法的100100倍左右。倍左右。n评价及
11、应用：评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（优点：操作简单，改良法灵敏度高（10g-6010g-60g），适合，适合测定蛋白含量少的标本。测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质缺点：各种蛋白质酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸比例不同，只适合测定比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。单一蛋白质。受一些药物干扰。比浊法比浊法n原理：原理：n评价及应用：评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）白絮状沉淀等）某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉
12、淀，某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂凝胶电泳可将血清蛋白质分为清蛋白、1、2、-球蛋白无部分。评价特异性好，了解蛋白质全貌的有价值方法电泳技术操作繁琐、费时、不易自动化紫外分光光度法紫外分光光度法 蛋白质分子中的蛋白质分子中的酪氨酸酪氨酸和和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在白质溶液在280nm280nm处有一吸收峰处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。核酸干扰。（1 1）Lowry-Lowry-KalckerK
13、alcker 公式公式 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mlmg/ml）=1.45 A=1.45 A 280280-0.74 A -0.74 A 260260 （2 2）Warburg-Christian Warburg-Christian 公式公式 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mlmg/ml）=1.55 A=1.55 A 280280-0.76 A -0.76 A 260260 n原理：原理：n评价及应用：评价及应用：优点：敏感而简便，可优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。紫外分光光度
14、计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm280nm测定易受尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受测定易受尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。影响。措施：在措施：在220-225nm220-225nm波长区域，用波长区域，用0.15mol/l0.15mol/l的的NaClNaCl稀释稀释1000-1000-20002000倍可消除干扰。倍可消除干扰。染料结合法染料结合法 在酸性环境下，带正电的蛋白质（在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可
15、既而用分光光度法子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。比色测定。n原理：原理：常用染料：常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等氨基黑，考马斯亮蓝等n评价及应用：评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。标准物不易确定。免疫化学法原理：血浆蛋白质具有抗原性，利用抗原和抗体的高度特异性反应，形成抗原-抗体复合物，再经过显色的深浅测定浓度有免疫比浊法、免疫扩散法、免疫沉淀法、免疫电泳法优点：定量测定
16、个别蛋白质，特异性好、灵敏度高缺点：成本高第二节 血清总蛋白测定原理 这种紫红色络合物在这种紫红色络合物在这种紫红色络合物在这种紫红色络合物在540nm540nm处的吸光度值与蛋白质的处的吸光度值与蛋白质的处的吸光度值与蛋白质的处的吸光度值与蛋白质的含量在含量在含量在含量在10120g/L10120g/L范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋范围内呈正比关系，与经过同样处理的蛋白质标准液比较，即可求出蛋白含量白质标准液比较，即可求出蛋白含量白质标准液比较，即可求出蛋白含量白质标准液比较，即可求出蛋白含量。540nm 条件：至
17、少含两个肽键（条件：至少含两个肽键（-CONH-CONH-）基团才能和）基团才能和CuCu2+2+形成络合物形成络合物,氨基酸及二肽无反氨基酸及二肽无反 应应,三肽以上才能反应。三肽以上才能反应。p参考范围：参考范围：成人成人606080g/L80g/Lp临床意义：临床意义：总蛋白升高：总蛋白升高：总蛋白降低：总蛋白降低：丢失过多丢失过多 吸收不足、消耗增加吸收不足、消耗增加 白蛋白合成减少白蛋白合成减少 血浆被稀释血浆被稀释真性升高：骨髓瘤、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病真性升高：骨髓瘤、巨球蛋白血症、自身免疫性疾病假性升高：机体明显失水，总蛋白含量相对升高，假性升高：机体明显失水，总蛋白含量
18、相对升高，A/GA/G几乎不变几乎不变第三节 血清清蛋白测定ALB由肝实质细胞合成，分子量66458，pI4-5.8，血浆中半衰期15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，约40%-60%电泳法电泳法特异性好，可了解血清蛋白质全貌但特异性好，可了解血清蛋白质全貌但电泳技术繁琐；白蛋白与染料亲和力高电泳技术繁琐；白蛋白与染料亲和力高会导致结果偏高。会导致结果偏高。免疫化学法免疫化学法特异性好，灵敏度高，适用于尿液和脑特异性好，灵敏度高，适用于尿液和脑脊液中微量清蛋白测定。脊液中微量清蛋白测定。染料结合法染料结合法染料结合法染料结合法:主要依据清蛋白可与溴甲酚绿（主要依据清蛋白可与溴甲酚绿（主要依据
19、清蛋白可与溴甲酚绿（主要依据清蛋白可与溴甲酚绿（BCGBCG）和溴甲酚紫）和溴甲酚紫）和溴甲酚紫）和溴甲酚紫（BCPBCP）结合的特性，而球蛋白几乎不结合或结合上述染料很慢，）结合的特性，而球蛋白几乎不结合或结合上述染料很慢，）结合的特性，而球蛋白几乎不结合或结合上述染料很慢，）结合的特性，而球蛋白几乎不结合或结合上述染料很慢，故临床自动化分析中通过缩短反应时间来去除干扰。故临床自动化分析中通过缩短反应时间来去除干扰。故临床自动化分析中通过缩短反应时间来去除干扰。故临床自动化分析中通过缩短反应时间来去除干扰。溴甲酚紫法（溴甲酚紫法（溴甲酚紫法（溴甲酚紫法（BCPBCP）：）：）：）：在在在在p
20、H5.2pH5.2的缓冲液中，有的缓冲液中，有的缓冲液中，有的缓冲液中，有Brij-35(Brij-35(聚环氧乙烯月桂酰醚聚环氧乙烯月桂酰醚聚环氧乙烯月桂酰醚聚环氧乙烯月桂酰醚)存在的存在的存在的存在的情况下，溴甲酚紫（情况下，溴甲酚紫（情况下，溴甲酚紫（情况下，溴甲酚紫（BCP)BCP)可与清蛋白结合形成绿色复合物，在可与清蛋白结合形成绿色复合物，在可与清蛋白结合形成绿色复合物，在可与清蛋白结合形成绿色复合物，在603nm603nm波长处的吸光度值与清蛋白的浓度成正比波长处的吸光度值与清蛋白的浓度成正比波长处的吸光度值与清蛋白的浓度成正比波长处的吸光度值与清蛋白的浓度成正比溴甲酚绿法（）：
21、溴甲酚绿法（）：溴甲酚绿法（）：溴甲酚绿法（）：血清清蛋白在血清清蛋白在血清清蛋白在血清清蛋白在pH4.2pH4.2的缓冲液中带有正电荷，在有非离子型的缓冲液中带有正电荷，在有非离子型的缓冲液中带有正电荷，在有非离子型的缓冲液中带有正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（BCGBCG）形形形形成成成成蓝绿色蓝绿色蓝绿色蓝绿色复合物，在复合物，在复合物，在复合物，在628nm628nm处有特殊的吸收峰，其颜色的深浅处有特殊的吸收峰，其颜色的深浅处有特殊的吸收峰，其颜色的深浅处有特殊的吸收峰，其颜色的深浅与清蛋白的浓度成正比与清蛋白的浓度成正比与清蛋白的浓度成正比与清蛋白的浓度成正比。p参考范围参考范围:成人成人353555g/L.55g/L.p临床意义：临床意义：白蛋白升高：白蛋白升高：白蛋白降低白蛋白降低：丢失过多丢失过多 消耗增加消耗增加 白蛋白合成减少白蛋白合成减少 水肿水肿 先天性先天性AlbAlb缺乏病缺乏病真性升高：未见真性升高：未见假性升高：机体明显失水，或治疗假性升高：机体明显失水，或治疗 输入过多白蛋白输入过多白蛋白