微生物的遗传变异22144.pptx

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1、第六章 微生物的遗传变异与菌种选育第一节第一节微生物遗传变异的物质基础微生物遗传变异的物质基础第二节第二节微生物的基因突变微生物的基因突变第三节第三节微生物的基因重组质微生物的基因重组质第四节第四节微生物的菌种选育微生物的菌种选育第五节第五节微生物菌种的保藏和复壮微生物菌种的保藏和复壮 第一节 微生物遗传变异的物质基础v种质连续理论种质连续理论：1883188918831889年间年间WeissmannWeissmann提出。认为提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。v基因学说基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使二十世纪初发现了

2、染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。2020多种氨基多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4 4种种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染

3、色体和基因，起活性成分是性成分是蛋白质蛋白质。vDNADNA是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明：19441944年以后，利年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌小鼠死亡抽取心血分离活的S菌一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验一、证

4、明核酸是遗传变异物质基础的经典实验一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验v（一）（一）（一）（一）肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验（transformationtransformation）：）：F.GriffithF.Griffith，v研究对象：研究对象：Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae（肺炎双（肺炎双球菌）球菌）vS S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜vR R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜（2

5、2）细菌培养实验）细菌培养实验）细菌培养实验）细菌培养实验热死热死热死热死S S菌菌菌菌不生长不生长不生长不生长活活活活R R 菌菌菌菌长出长出长出长出RR菌菌菌菌热死热死热死热死S S菌菌菌菌+活活活活R R 菌菌菌菌长出大量长出大量长出大量长出大量RR菌和菌和菌和菌和1010-6-6S S菌菌菌菌（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的S S型细菌细胞内可能存在型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入一种转化物质，它能通过某种方式进入R R型细胞并型细胞并使使R R型细胞获得稳定的遗传性状型细

6、胞获得稳定的遗传性状vv加加S S菌菌DNADNAvv加加S S菌菌DNADNA及及DNADNA酶以酶以 外的酶外的酶vv加加S S菌的菌的DNADNA和和DNADNA酶酶vv加加S S菌的菌的RNARNAvv加加S S菌的蛋白质菌的蛋白质vv加加S S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的

7、，是遗传因子。（二）噬菌体的感染实验A.D.HersheyA.D.Hershey和和M.ChaseM.Chase，1952 1952年年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验v为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。v将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而

8、且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。v选用选用TMVTMV和和霍氏车前花叶病毒（霍氏车前花叶病毒（HRVHRV），分别，分别拆分取得各自的拆分取得各自的RNARNA和蛋白质，将两种和蛋白质，将两种RNARNA分分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1 1）RNARNA（TMVTMV）蛋白质（蛋白质（HRVHRV）（2 2）RNARNA（HRVHRV）蛋白质（蛋白质（TMVTMV）v用两种杂合病毒感染寄主：用两种杂合病毒感染寄主：（1 1）表现）表现TMVTMV的典型症状病分离到正常的典型症状病分离到正常TMVTMV粒子粒子（2 2）表现）表现HR

9、VHRV的典型症状病分离到正常的典型症状病分离到正常HRVHRV粒子。粒子。v上述结果说明，在上述结果说明，在RNARNA病毒中，病毒中，遗传的物质基遗传的物质基础也是核酸。础也是核酸。二、遗传物质在细胞中的存在方式 1.细胞水平 2.亚细胞核水平 3.分子水平一、基因突变 基因突变（gene mutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-810-9范围内。第二节 微生物的基因突变 突变株的表型突变株的表型成因成因检出方法检出方法 营养缺陷型营养缺陷型 因突变而丧失合成一因突变而丧失合成一补充培养基补充培养基（auxotro

10、phauxotroph）种或几种生长因子的种或几种生长因子的 能力不能在基本培养能力不能在基本培养 基上生长突变株基上生长突变株 抗性突变型抗性突变型 因突变而产生了对某因突变而产生了对某药物培养基药物培养基（resistant mutantresistant mutant）种化学药物或致死种化学药物或致死 物理因子的抗性物理因子的抗性 条件致死型条件致死型 突变后在某种条件下突变后在某种条件下 培养条件改变培养条件改变（conditional conditional 可正常生长、繁殖并可正常生长、繁殖并 lethal mutantlethal mutant）实现其表型，而在另实现其表型，而在

11、另 一条件下却无法生长一条件下却无法生长 繁殖的突变型繁殖的突变型一、基因突变的类型一、基因突变的类型突变株的表型突变株的表型成因成因 检出方法检出方法形态突变型形态突变型 因突变而产生的个体因突变而产生的个体 形态形态Morphologycal Morphologycal 或菌落形态的非选择或菌落形态的非选择 （常用（常用颜色变化）颜色变化）mutant mutant 性变异性变异抗原突变型抗原突变型 因突变而引起的抗原因突变而引起的抗原 借借助于抗原助于抗原antigenic antigenic 结构发生改变结构发生改变 抗体抗体反应反应 mutantmutant其它突变型：毒力、糖发酵能

12、力、代谢产物等其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等二、突变的特点二、突变的特点1.1.不对应性不对应性不对应性不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）2.2.自发性自发性自发性自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。：突变可以在没有人

13、为诱变因素处理下自发地产生。：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.3.稀有性稀有性稀有性稀有性：突变率低且稳定。突变率低且稳定。突变率低且稳定。突变率低且稳定。4.4.独立性独立性独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。：各种突变独立发生，不会互相影响。5.5.可诱发性可诱发性可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。6.6.稳定性稳定性稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。7.7.可逆

14、性可逆性可逆性可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutationforward mutation），相反的过程则称为回复突变或回变），相反的过程则称为回复突变或回变），相反的过程则称为回复突变或回变），相反的过程则称为回复突变或回变（backback mutationmutation或或或或 reverse mutation reverse mutation）。）。）。）。.诱发突变的机制诱发突变的机制诱变剂（mutagen）：凡能提高突

15、变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。三、基因突变的机制碱基置换（碱基置换（substitution）定义定义：对对DNADNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（伤（microlesionmicrolesion），一般也称点突变（），一般也称点突变（point mutationpoint mutation）。）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类分类：转换转换（transitiontransition），即），即DNADNA链中的一个嘌呤被另一个嘌链中

16、的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换颠换（transversiontransversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。个嘧啶被另一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂一类可直接与核

17、酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-N-甲基甲基-N-N硝基硝基-N-N-亚硝基胍，亚硝基胍，N-N-甲基甲基-N-N-亚硝基脲，乙烯亚亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起GCA：T外，其余都是可使GC A：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。移码突变移码突变移码突变移码突变（frame-shift mutationframe-shift

18、mutation）指诱变剂使）指诱变剂使DNADNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株移码突变株（frame shift mutantframe shift mutant）。与染色体畸变相比，移）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是码突变也只能算是DNADNA分子的微小损伤。分子的微小损伤。丫啶类染料，如丫啶黄、丫啶橙和丫啶类染料，如丫啶黄

19、、丫啶橙和-氨基丫啶等，氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。都是移码突变的有效诱变剂。丫啶类化合物的诱变机制丫啶类化合物的诱变机制至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。染色体畸变（染色体畸变（chromosomal aberration）某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrol

20、esion）染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失（缺失（deletiondeletion）、重复）、重复（duplicationduplication）、易位（）、易位（translocationtranslocation）和倒位（）和倒位（inversioninversion）染色体数目的变化。染色体结构上的变化染色体结构上的变化v染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分生染色体的部分缺失缺失或或重复重复时，其结果可造成时，其结果可造成基基因的减少或增加因的减少或增加；又如发生；又如发生倒位倒位或或易位易位时，则可时，则可

21、造成造成基因排列顺序的改变基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的位是指断裂下来的DNADNA片段旋转片段旋转180180后，重新后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。色体的其它部位上。v染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。紫外线（紫外线（U.V.，ultraviolet ray）对）对DNA的损伤的损伤 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多嘧啶对紫外线的敏感性要比

22、嘌呤强得多。嘧啶的光化产。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧胸腺嘧啶二聚体啶二聚体的形成和消除。的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链紫外线的主要作用是使同链DNADNA的相邻胸腺嘧啶间形成的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会

23、妨碍双链的解开，二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响因而影响DNADNA的复制和转录，并使细胞死亡。的复制和转录，并使细胞死亡。.自身突变的机制自身突变的机制背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应微生物自身代谢产物的诱变效应互变异构效应环状突出效应 第三节第三节 微生物的基因重组微生物的基因重组 基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组 紧密缠绕的环状双链紧密缠绕的环状双链DNADNA分子分子 遗传信息的连续性遗传信息的连续性 功能相关的结构基因组成操纵子结构功能相关的

24、结构基因组成操纵子结构 结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及rRNArRNA基因的多拷贝基因的多拷贝 基因组的重复序列少而短基因组的重复序列少而短二、真核生物的基因重组二、真核生物的基因重组 DNADNA与组蛋白构成染色体与组蛋白构成染色体 有间隔子或内含子序列有间隔子或内含子序列 没有明显的操纵子结构没有明显的操纵子结构 含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）遗传丰余遗传丰余：较高同源性的：较高同源性的DNADNA重复序列重复序列 第四节第四节 微生物的菌种选育微生物的菌种选育 在在在在在在微微微微微微生生生生生生物物物物物物工工工工工工

25、业业业业业业应应应应应应用用用用用用中中中中中中，微微微微微微生生生生生生物物物物物物菌菌菌菌菌菌种种种种种种工工工工工工作作作作作作主主主主主主要要要要要要包包包包包包括以下四方面：括以下四方面：括以下四方面：括以下四方面：括以下四方面：括以下四方面：菌菌菌菌菌菌种种种种种种的的的的的的分分分分分分离离离离离离筛筛筛筛筛筛选选选选选选：挑挑挑挑挑挑选选选选选选符符符符符符合合合合合合生生生生生生产产产产产产要要要要要要求求求求求求的的的的的的菌菌菌菌菌菌种种种种种种，这这这这这这是选种工作的任务。是选种工作的任务。是选种工作的任务。是选种工作的任务。是选种工作的任务。是选种工作的任务。菌菌菌

26、菌菌菌种种种种种种培培培培培培育育育育育育：改改改改改改良良良良良良已已已已已已有有有有有有菌菌菌菌菌菌种种种种种种的的的的的的生生生生生生产产产产产产性性性性性性能能能能能能，使使使使使使产产产产产产品品品品品品的的的的的的质质质质质质和和和和和和量量量量量量不不不不不不断断断断断断提提提提提提高高高高高高，或或或或或或使使使使使使它它它它它它更更更更更更适适适适适适应应应应应应于于于于于于工工工工工工艺艺艺艺艺艺的的的的的的要要要要要要求求求求求求，这这这这这这是是是是是是育育育育育育种工作的任务。种工作的任务。种工作的任务。种工作的任务。种工作的任务。种工作的任务。菌菌菌菌菌菌种种种种种

27、种的的的的的的保保保保保保藏藏藏藏藏藏：一一一一一一切切切切切切生生生生生生产产产产产产菌菌菌菌菌菌种种种种种种都都都都都都要要要要要要使使使使使使它它它它它它避避避避避避免免免免免免死死死死死死亡亡亡亡亡亡和和和和和和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。退退退退退退化化化化化化菌菌菌菌菌菌种种种种种种的的的的的的复复复复复复壮壮壮壮壮壮：如如如如如如果果果果果果发发发发发发现现现现现现菌菌菌

28、菌菌菌种种种种种种的的的的的的生生生生生生产产产产产产性性性性性性能能能能能能下下下下下下降降降降降降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采采采采 样样样样增增 殖殖 培培 养养增增 殖殖 培培 养养 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌

29、落：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1稀释分离法稀释分离法 2平板划平板划线线分离法分离法 涂菌涂菌：划划线线分离分离：分步划分步划线线法法；一次划一次划线线法：法：3组织组织分离法分离法 测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状测定代谢产物或其它目的性状（一）诱变育种的一般步骤和方法（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株出发菌株同步培养同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状使菌细胞处于相同或接近的生理状态态单细单细胞（或胞（或单孢单孢子）菌子）菌悬悬液的制液的制备备 单细胞或单孢子的意义单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子酵母或霉菌孢子1010

30、6 6/ml /ml、细菌、细菌10108 8/ml /ml 诱变剂诱变剂的的选择选择及其及其剂剂量的确定量的确定 以致死率为以致死率为90909999 为宜为宜诱变处理诱变处理 物理诱变剂物理诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂确定出发菌株确定出发菌株确定出发菌株确定出发菌株菌种的纯化选优菌种的纯化选优菌种的纯化选优菌种的纯化选优出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定出发菌株的性能鉴定同步培养同步培养同步培养同步培养制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液制备单细胞（或单孢子）悬液活菌浓度测定活菌浓度测定活菌浓度测定活菌浓度测定诱变剂的选择与确定

31、诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验诱变处理诱变处理诱变处理诱变处理平板分离平板分离平板分离平板分离计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养挑取疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选突变体的初步筛选突变体的初步筛选突变体的初步筛选用简单快捷的方法用简单快捷的方法用简单快捷的方法用简单快捷的方法重复筛选重复筛选重复筛选重复筛选摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验摇瓶发酵试验选

32、选选选出出出出突突突突变变变变体体体体（根根根根据据据据情情情情况况况况进进进进行行行行生生生生产产产产试试试试验验验验或或或或重重重重复复复复诱诱诱诱变处理）变处理）变处理）变处理）二、微生二、微生物的诱变物的诱变育种育种二、微生物的诱变育种二、微生物的诱变育种（二）变异菌株的初步筛选（二）变异菌株的初步筛选（二）变异菌株的初步筛选（二）变异菌株的初步筛选 纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法琼脂块培养法1 1 1 1 1 1 筛选用培养基筛选用培养基筛选用培养基筛选用培养基筛选用培养基筛选用培养基 基基

33、基基基基本本本本本本培培培培培培养养养养养养基基基基基基：凡凡凡凡凡凡是是是是是是能能能能能能满满满满满满足足足足足足某某某某某某种种种种种种野野野野野野生生生生生生型型型型型型菌菌菌菌菌菌株株株株株株营营营营营营养养养养养养要要要要要要求求求求求求的的的的的的最最最最最最低低低低低低成成成成成成分分分分分分的合成培养基，称为基本培养基；常以的合成培养基，称为基本培养基；常以的合成培养基，称为基本培养基；常以的合成培养基，称为基本培养基；常以的合成培养基，称为基本培养基；常以的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示；表示；表示；表示；表示；表示；在在在在在在基基基基基基本本本本本本培培培培培培

34、养养养养养养基基基基基基中中中中中中加加加加加加入入入入入入一一一一一一些些些些些些富富富富富富含含含含含含氨氨氨氨氨氨基基基基基基酸酸酸酸酸酸、维维维维维维生生生生生生素素素素素素及及及及及及含含含含含含氮氮氮氮氮氮碱碱碱碱碱碱基基基基基基之之之之之之类类类类类类的的的的的的天天天天天天然然然然然然有有有有有有机机机机机机物物物物物物质质质质质质如如如如如如蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白胨胨胨胨胨胨、酵酵酵酵酵酵母母母母母母膏膏膏膏膏膏等等等等等等，以以以以以以满满满满满满足足足足足足该该该该该该微微微微微微生生生生生生物物物物物物的的的的的的各各各各各各种种种种种种营营营营营营养养养养养养缺缺缺

35、缺缺缺陷陷陷陷陷陷型型型型型型菌菌菌菌菌菌株株株株株株都都都都都都能能能能能能生生生生生生长长长长长长繁繁繁繁繁繁殖殖殖殖殖殖的的的的的的培培培培培培养养养养养养基基基基基基，称称称称称称为为为为为为完完完完完完全全全全全全培培培培培培养养养养养养基基基基基基，常常常常常常用用用用用用+表示；表示；表示；表示；表示；表示；在在在在在在基基基基基基本本本本本本培培培培培培养养养养养养基基基基基基中中中中中中只只只只只只是是是是是是有有有有有有针针针针针针对对对对对对性性性性性性地地地地地地加加加加加加入入入入入入某某某某某某一一一一一一种种种种种种或或或或或或某某某某某某几几几几几几种种种种种种

36、营营营营营营养养养养养养缺缺缺缺缺缺陷陷陷陷陷陷成成成成成成分分分分分分，以以以以以以满满满满满满足足足足足足相相相相相相应应应应应应的的的的的的营营营营营营养养养养养养缺缺缺缺缺缺陷陷陷陷陷陷型型型型型型生生生生生生长长长长长长的的的的的的培培培培培培养养养养养养基基基基基基，称称称称称称为为为为为为补补补补补补充充充充充充培培培培培培养养养养养养基基基基基基，补补补补补补充充充充充充培培培培培培养养养养养养基基基基基基可可可可可可按按按按按按所所所所所所加加加加加加入入入入入入营营营营营营养养养养养养成成成成成成分分分分分分相相相相相相应应应应应应地地地地地地用用用用用用AAA、BBB等来

37、表示。等来表示。等来表示。等来表示。等来表示。等来表示。（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用 二、微生物的诱变育种2营养缺陷型菌株筛选的一般方法营养缺陷型菌株筛选的一般方法（1 1）诱变剂处理）诱变剂处理）诱变剂处理）诱变剂处理 （2 2）淘汰野生型菌株）淘汰野生型菌株）淘汰野生型菌株）淘汰野生型菌株 抗生素法抗生素法抗生素法抗生素法 菌丝过滤法菌丝过滤法菌丝过滤法菌丝过滤法（3 3）检检检检出出出出营营营营养缺陷型养缺陷型养缺陷型养缺陷型 （4 4）鉴鉴鉴鉴定定定定营营营营养缺陷型养缺

38、陷型养缺陷型养缺陷型 检出营养缺陷型检出营养缺陷型 夹夹 层层 培培 养养 法法夹夹 层层 培培 养养 法法 限限量量补补充充培培养养法法限限量量补补充充培培养养法法 影影 印印 接接 种种 法法影影 印印 接接 种种 法法 逐逐个个检检出出法法逐逐个个检检出出法法鉴定营养缺陷型 含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。营养缺陷型营养类别的鉴定。营养缺陷型营养类别的鉴定。营养缺陷型营养类别的鉴定。营养缺陷型营养类别的鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的

39、鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。第一组第一组第一组第一组第二组第二组第二组第二组第三组第三组第三组第三组第四组第四组第四组第四组第五组第五组第五组第五组第六组第六组第六组第六组第七组第七组第七组第七组第八组第八组第八组第八组第九组第九组第九组第九组丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸亮氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸谷氨酰氨谷氨酰氨谷氨酰氨谷氨酰氨赖氨酸赖氨酸赖氨酸赖氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰氨天冬酰氨天冬酰氨天冬酰氨甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸蛋氨酸色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸天冬氨酸天冬氨

40、酸天冬氨酸天冬氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸脯氨酸 缬氨酸缬氨酸缬氨酸缬氨酸原生质体融合育种原生质体融合育种 细胞（细胞（细胞（细胞（A A+B B）细胞（细胞（细胞（细胞（A AB B+）脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理脱壁处理原生质体（原生质体（原生质体（原生质体（A A+B B）原生质体（原生质体（原生质体（原生质体（A AB B+）混合混合混合混合 加融合剂加融合剂加融合剂加融合剂原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合

41、涂平板（原生质体再生）涂平板（原生质体再生）涂平板（原生质体再生）涂平板（原生质体再生）形成菌落形成菌落形成菌落形成菌落检出重组子菌落（检出重组子菌落（检出重组子菌落（检出重组子菌落（A A+B B+）转基因工程菌株的构建转基因工程菌株的构建 1 1提提取取目目的的基基因因 用用密密度度梯梯度度离离心心方方法法分分别别从从供供体体细细胞胞中中提提取取所所需需要要的的DNADNA即即目目的的基基因因和和作作为为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。2 2处处理理目目的的基基因因 根根据据基基因因工工程程的的“设

42、设计计蓝蓝图图”的的要要求求，在在从从供供体体细细胞胞中中提提取取出出的的目目的的基基因因中中加加入入专专一一性性很很强强的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶进进行行处处理理，从从而而获获得得带带有有特特定定基基因因并并暴暴露露出出粘粘性性末末端端的的DNADNA单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。对对作作为为载载体体的的细细菌菌质质粒粒或或噬噬菌菌体体DNADNA可可采采用用与与处处理理目目的的基基因因同同一一种种类类的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶进进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。行处理，使其形成并暴露出与

43、目的基因相应的粘性末端。3 3体体外外重重组组 将将上上述述分分别别处处理理过过的的目目的的基基因因和和细细菌菌质质粒粒DNADNA片片段段（或或噬噬菌菌体体核核酸酸）放放在在试试管管中中，在在较较低低温温度度（5 56 6）下下混混合合“退退火火”。由由于于这这两两种种DNADNA是是用用同同一一种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶进进行行处处理理，具具有有相相同同的的粘粘性性末末端端，因因此此相相互互之之间间能能够够形形成成氢氢键键，这这就就是是所所谓谓“退退火火”。而而相相邻邻的的核核苷苷酸酸，在在DNADNA连连接接酶酶的的作作用用下下也也能能形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，这这样样就就

44、完完成成了了目目的的基基因因与与质质粒粒DNADNA（或或噬噬菌菌体体DNADNA）的的重重组组，得得到到的的是是一一个个完完整整的的具具有有复复制制能能力力的的环环状状DNADNA重重组组体体，即即“杂杂种种质质粒粒”（或杂种噬菌体）。（或杂种噬菌体）。4 4载载体体传传递递 即即通通过过载载体体将将供供体体生生物物中中的的遗遗传传基基因因导导入入到到受受体体细细胞胞内内。载载体体必必须须具具有有自自我我复复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。5 5复复制制、表表达达

45、在在理理想想情情况况下下，进进入入受受体体细细胞胞内内的的杂杂种种质质粒粒（或或杂杂种种噬噬菌菌体体），可可通通过过自自我我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌工程菌”。6 6筛筛选选、繁繁殖殖 当当前前，由由于于分分离离纯纯净净的的基基因因功功能能单单位位还还很很困困难难，所所以以通通过过重重组组后后的的“杂杂种种质质粒粒”的的性性状状是是否否都都符符合合原原定定的的“设设计计蓝蓝图图”，以以及及它它能能否否在在受受体体细细胞胞内内正正常常增增殖殖和和表表达达等等，都都还还需需要要经经

46、过过仔仔细细检检查查，以以便便能能在在大大量量个个体体中中设设法法筛筛选选出出所所需需要要性性状状的的个个体体，然然后后才才可可加加以以繁繁殖殖和和利利用。用。第五节第五节 微生物菌种的保藏和复壮微生物菌种的保藏和复壮一、菌种的保藏一、菌种的保藏一、菌种的保藏 1 11低低低低低低温温温温温温保保保保保保藏藏藏藏藏藏法法法法法法 斜斜斜斜斜斜面面面面面面菌菌菌菌菌菌种种种种种种直直直直直直接接接接接接放放放放放放入入入入入入0 004 44冰冰冰冰冰冰箱箱箱箱箱箱中中中中中中保保保保保保藏藏藏藏藏藏，保保保保保保存存存存存存时时时时时时间间间间间间不不不不不不宜宜宜宜宜宜过过过过过过长长长长长

47、长，一一一一一一般般般般般般为为为为为为 3 336 66个个个个个个月月月月月月；用用用用用用-20-20-20以以以以以以下下下下下下的的的的的的超超超超超超低低低低低低温温温温温温冰冰冰冰冰冰箱箱箱箱箱箱或或或或或或干干干干干干冰冰冰冰冰冰、液液液液液液氮（氮（氮（氮（氮（氮（-195-195-195）冻结保藏，长达数年。）冻结保藏，长达数年。）冻结保藏，长达数年。）冻结保藏，长达数年。）冻结保藏，长达数年。）冻结保藏，长达数年。2 22干干干干干干燥燥燥燥燥燥保保保保保保藏藏藏藏藏藏法法法法法法 主主主主主主要要要要要要是是是是是是指指指指指指把把把把把把菌菌菌菌菌菌种种种种种种接接接

48、接接接种种种种种种到到到到到到适适适适适适当当当当当当载载载载载载体体体体体体上上上上上上，在在在在在在干干干干干干燥燥燥燥燥燥条条条条条条件件件件件件下下下下下下进进进进进进行行行行行行保保保保保保藏藏藏藏藏藏。这这这这这这种种种种种种保保保保保保藏藏藏藏藏藏方方方方方方法法法法法法主主主主主主要要要要要要适适适适适适合合合合合合于于于于于于细细细细细细菌菌菌菌菌菌的的的的的的芽芽芽芽芽芽胞胞胞胞胞胞和和和和和和霉霉霉霉霉霉菌菌菌菌菌菌的的的的的的孢孢孢孢孢孢子子子子子子。细细细细细细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。菌芽胞用沙土管保

49、藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。333隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法隔绝空气保藏法 用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，4 44真真真真真真空空空空空空冷冷冷冷冷冷冻冻冻冻冻冻干干干干干干燥燥燥燥燥燥保保保保保保藏藏藏藏藏藏法法法法法法 其其其其其其基基基基基基本本本

50、本本本过过过过过过程程程程程程是是是是是是：培培培培培培养养养养养养菌菌菌菌菌菌种种种种种种加加加加加加菌菌菌菌菌菌种种种种种种保保保保保保护护护护护护剂剂剂剂剂剂（一一一一一一般般般般般般食食食食食食品品品品品品工工工工工工业业业业业业用用用用用用菌菌菌菌菌菌种种种种种种多多多多多多用用用用用用牛牛牛牛牛牛乳乳乳乳乳乳作作作作作作保保保保保保护护护护护护剂剂剂剂剂剂）分分分分分分装装装装装装、预预预预预预冻冻冻冻冻冻真真真真真真空空空空空空冻冻冻冻冻冻干干干干干干真空封口。真空封口。真空封口。真空封口。真空封口。真空封口。555寄主保藏法寄主保藏法寄主保藏法寄主保藏法寄主保藏法寄主保藏法 用