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1、实验三线粒体和细胞核的制备实验三线粒体和细胞核的制备与观察与观察第1页，本讲稿共19页实验目的实验目的掌握用掌握用差速离心差速离心法分离动物细胞核及线法分离动物细胞核及线粒体的技术粒体的技术.掌握分级分离细胞核与线粒体的纯度检掌握分级分离细胞核与线粒体的纯度检测方法测方法学习线粒体活性染色技术学习线粒体活性染色技术,观察活细胞内观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布线粒体的形态、数量与分布 了解密度梯度离心法纯化线粒体的方法了解密度梯度离心法纯化线粒体的方法.第2页，本讲稿共19页实验原理实验原理制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心
2、差速离心的方法的方法悬浮介质通常采用悬浮介质通常采用一定一定pHpH的缓冲蔗糖溶液的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性.詹纳斯绿詹纳斯绿B B是一种是毒性较小的是一种是毒性较小的碱性染料，能对动植物的细胞或组织在碱性染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下活体状态下进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下
3、来。它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。细胞核由细胞核由脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，在所组成，在DNADNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电带正电荷的碱性染料荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物以离子或氢键结合而被染色，此外，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，质，因此，詹纳斯绿詹纳斯绿B B也能被堆积下来而使细胞核呈现也能被堆积下来而使细胞核呈现蓝色。蓝色。线粒
4、体内膜上分布有细胞色素氧化酶线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B B染料保持在染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色.线粒体能在詹纳斯绿线粒体能在詹纳斯绿B B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布；状态的线粒体的形态和分布；第3页，本讲稿共19页詹纳斯绿詹纳斯绿B B(Janus green B)性状性状:棕色呈深棕色结晶性粉棕色呈深棕色结晶
5、性粉末，溶于水呈蓝色，微溶于末，溶于水呈蓝色，微溶于醇。醇。用途用途:用于线粒体活体染色，真用于线粒体活体染色，真菌和原虫染色，胚胎切片染色，菌和原虫染色，胚胎切片染色，以及用作氧化还原指示剂和铜的以及用作氧化还原指示剂和铜的电镀添加剂电镀添加剂碱性染料的胶粒表面带有阳离碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来吸引作用，染料就被堆积下来分子结构式分子式：C30H31ClN6第4页，本讲稿共19页活体染色活体染色 活体染色是指对生活有机体的细胞活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能
6、着色但又无毒害的或组织能着色但又无毒害的一种染色方一种染色方法。法。它的目的是显示生活细胞内的某些它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。亡。活染技术活染技术可用来研究可用来研究生活状态下生活状态下的的细胞形态结构和生理、病理状态。细胞形态结构和生理、病理状态。第5页，本讲稿共19页活体染色活体染色 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分通常把活体染色分为为体内活染体内活染和和体外活染体外活染两类。两类。体内活体染色
7、：体内活体染色：是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。易于识别的目的。体外活体染色体外活体染色(超活染色超活染色)：它是由活的动、植物分离出部分细胞或组它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。作为活体染色剂作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料，而对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。且总要配
8、成稀淡的溶液来使用。活体染料多为碱性染料活体染料多为碱性染料,如中性红如中性红,詹纳斯绿詹纳斯绿B,B,次甲基蓝等次甲基蓝等对某种细胞器的染色具有专一性对某种细胞器的染色具有专一性,如中性红染液泡如中性红染液泡,Janus green B,Janus green B染线染线粒体。粒体。第6页，本讲稿共19页实验用品实验用品 实验材料实验材料小白鼠肝脏小白鼠肝脏人口腔粘膜上皮细胞人口腔粘膜上皮细胞用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠肝剪成小块用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠肝剪成小块放入小烧杯内用吸管吸取生理盐水，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。放入小烧杯内用吸管
9、吸取生理盐水，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。第7页，本讲稿共19页 实验用品实验用品实验试剂实验试剂0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)0.2%和0.02%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 生理盐水 实验实验仪仪器器：显微镜，高速冷冻离心机,玻璃匀浆器,解剖刀，剪刀，漏斗，尼龙网，刻度离心管等第8页，本讲稿共19页实验内容实验内容小鼠细胞器小鼠细胞器(细胞核细胞核,线粒体线粒体)的分离提取的分离提取分离提取物分离提取物(细胞核细胞核,线粒体线粒体)鉴定鉴定人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色密度梯
10、度离心法纯化线粒体密度梯度离心法纯化线粒体()()第9页，本讲稿共19页1.1.细胞器细胞器(细胞核细胞核,线粒体线粒体)的分离提取的分离提取(1(1）获取肝脏：获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠用颈椎脱臼法处死小鼠,置于解剖盘中置于解剖盘中剪开腹腔剪开腹腔,迅速取出小鼠肝迅速取出小鼠肝,称重称重1 1克克放入小烧杯内用放入小烧杯内用吸管吸取吸管吸取预冷预冷的生理盐水洗净血液。的生理盐水洗净血液。(2(2）匀浆：匀浆：将将鼠肝鼠肝剪碎剪碎置于置于预冷预冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器中，加入中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器中，加
11、入1010mlml预冷预冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂裂(分次加入匀浆液分次加入匀浆液)。（。（注：整过程在冰浴上进行注：整过程在冰浴上进行）(3(3）过滤：过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷预冷的小烧杯中。的小烧杯中。实验步骤实验步骤第10页，本讲稿共19页（4）细胞核与线粒体分离：细胞核与线粒体分离：沉淀2（制1张装片C，做好标记）（细胞核及碎片）上清液2（制1张装片D，做好标记）匀浆液匀浆液8ml，4下下,700g 离心离心10min沉淀沉淀1（制（制1张张装片装片A，标记，标记A1,A2）(组
12、织、细胞核、线粒体及碎片等）组织、细胞核、线粒体及碎片等）上清液1（制1张装片B，做好标记）洗涤，洗涤，8ml预冷预冷的的0.25mol/L蔗糖缓蔗糖缓洗涤液洗涤液1次，次，1000 g离心离心15min第11页，本讲稿共19页上清液上清液1与上清上清2合并合并，11000 g离心离心10min沉淀3（制1张装片E，做好标记）（线粒体）要进一步得到更纯的线粒体可再洗涤两次或密度梯度离心法纯化注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上第12页，本讲稿共19页2.2.分离提取物鉴定分离提取物鉴定将共将共5 5张张制片制片，不待干即滴加，不待干即滴加0.2%Janus greenB0.2%Jan
13、us greenB染色染色20min20min后后（暗处反应）（暗处反应）,盖上盖玻片，镜检，分散相的盖上盖玻片，镜检，分散相的线粒体线粒体被染成浅蓝被染成浅蓝色，色，呈圆形或椭圆形颗粒呈圆形或椭圆形颗粒。如果线粒体聚集成堆则被染成深。如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认蓝色，难以辨认。装片中的装片中的细胞核细胞核，也被染成较深的蓝色，而，也被染成较深的蓝色，而血细胞血细胞不着色。不着色。注意：注意：得到的沉淀物须得到的沉淀物须加加预冷预冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液将其蔗糖缓冲液将其悬浮后再装片悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小滴，量太，制线粒体装片时，悬浮
14、液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。多线粒体易聚集成堆，不便观察。实验步骤实验步骤第13页，本讲稿共19页实验步骤实验步骤3 3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察将载玻片将载玻片(必须十分清洁必须十分清洁)平放在桌面上，滴平放在桌面上，滴2 2滴滴0.02%0.02%詹纳斯詹纳斯绿绿B B染液于载玻片中央；染液于载玻片中央；用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞皮细胞(粘液状物粘液状物)，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染色，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染色5-5-15m
15、in(15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上玻，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干；片，四周溢出的染液用吸水纸吸干；低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体 。第14页，本讲稿共19页实验步骤实验步骤4.4.密度梯度离心法纯化线粒体密度梯度离心法纯化线粒体(自选自选)35,000rpm/1h使用
16、超高速离心机第15页，本讲稿共19页实验结果实验结果图2：人口腔粘膜上皮细胞(示线粒体)图1：小鼠肝细胞核在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状颗粒（绿色箭头所指）（注意：可见蓝绿色渐渐变淡现象，蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失）注：红色箭头所指为细胞核第16页，本讲稿共19页在显微镜下观察到的离体线粒体第17页，本讲稿共19页匀浆缓冲液预冷(4)冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。试验全过程要在04进行,离心机温度设为 4 整个分离过程不宜过长,要尽快。
17、离心机使用：离心管要平衡g为离心力(RCF)RCF(g)=1.11810-5 r(rpm)2r:有效半径(cm),rpm:转速(转/分)注意事项注意事项只有2台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷.第18页，本讲稿共19页1.分别描述五张装片的结果(如逐级分离中看到哪些细胞组分，平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少，等)2.根据你的实验结果和你所获得的知识,你认为用此分离方法所分离的线粒体的纯度如何?有什么改进方法？3.绘出人口腔粘膜上皮细胞图(示线粒体的形态与分布)实验报告实验报告第19页，本讲稿共19页