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1、(1)微生物的分离与培养(2)某种微生物数量的测定(3)培养基对微生物的选择作用(4)利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用(1)培养基的种类、营养要求及配制原则(2)无菌技术的内容及方法(3)分离纯化微生物的研究思路、方法一、微生物的实验室培养1培养基的营养构成营养营养物质物质定义定义作用作用主要来源主要来源碳源碳源能提供碳元能提供碳元素的物质素的物质构成生物体的物构成生物体的物质，异养生物的质，异养生物的能源物质能源物质无机物：无机物：CO2、NaHCO3有机物：糖类、有机物：糖类、脂肪酸、石油、脂肪酸、石油、花生粉饼等花生粉饼等营养营养物质物质定义定义作用作用主要来源主
2、要来源氮源氮源能提供氮元素能提供氮元素的物质的物质合成蛋白质、合成蛋白质、核酸以及含氮核酸以及含氮代谢产物代谢产物无机物：无机物：N2、NH3、氨盐、氨盐、硝酸盐硝酸盐有机物：尿素、有机物：尿素、牛肉膏、蛋白牛肉膏、蛋白胨等胨等生长生长因子因子生长不可缺少生长不可缺少的微量有机物的微量有机物酶和核酸的成酶和核酸的成分分维生素、氨基维生素、氨基酸、碱基等酸、碱基等(1)微生物最常利用的碳源是糖类(特别是葡萄糖)，常利用的氮源是氨盐、硝酸盐。(2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源。(3)微生物之所以需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。2大肠杆菌的纯化大肠杆菌
3、的纯化培养，包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段。(1)培养基的配制流程(以牛肉膏蛋白胨培养基为例)计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL的培养基时，各种成分的用量。称量：准确地称取各种成分。溶化：先将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。然后往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠，最后加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至100 mL。灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中加棉塞包好，放入高压灭菌锅，在压力为100 kPa、温度为121 条件下，
4、灭菌1530 min。将培养皿包好后放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2 h。倒平板：等培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。(2)纯化大肠杆菌平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。(3)培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基(对照
5、组)都放入37 恒温箱中，培养12 h和24 h后，分别观察并记录结果。3无菌技术(1)消毒和灭菌的区别条件条件结果结果常用的方法常用的方法消消毒毒较为温和的较为温和的物理或化学物理或化学方法方法仅杀死物体表面仅杀死物体表面或内部一部分对或内部一部分对人体有害的微生人体有害的微生物物(不包括芽孢和不包括芽孢和孢子孢子)煮沸消毒法、巴煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外氏消毒法、紫外线或化学药物消线或化学药物消毒法毒法灭灭菌菌强烈的理化强烈的理化因素因素杀死物体内外所杀死物体内外所有的微生物，包有的微生物，包括芽孢和孢子括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌灭菌酒精消毒
6、时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。(2)无菌技术主要操作要求实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所有器具和培养基灭菌。实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1选择合适的培养基(1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基培养基培养基种类种类特点特点用途用途选择培选择培养基养基培养基中加入某种化培养基中加入某种化学物质，以抑制不需学物质，以抑制不需要的微生物的生长，要的微生物的生长，促进所需要的微生物促进所需要的微生物的生长的生长
7、培养、分离出特定微培养、分离出特定微生物生物(如培养酵母菌和如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中霉菌，可在培养基中加入青霉素；用尿素加入青霉素；用尿素作为唯一氮源的培养作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素基用于分离分解尿素的细菌的细菌)(2)分离分解尿素的细菌的培养基即为选择培养基，培养基中的氮源只有尿素，理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。培养培养基种基种类类特点特点用途用途鉴别鉴别培养培养基基根据微生物的代根据微生物的代谢特点，在培养谢特点，在培养基中加入某种指基中加入某种指示剂或化学药品示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如鉴别不同种类的微生物，如可用伊红可用伊红美蓝培养基鉴别美蓝培
8、养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽并带有金属光泽)2统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计一定容积的样品中微生物数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操作a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。计算公式：每
9、克样品中的菌株数 ，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。3细菌分离与计数的实验流程细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数三、分解纤维素的微生物的分离1纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2纤维素分解菌的筛选原理(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。(2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。3土壤中纤维素分解菌的筛选(1)方案土
10、壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。(2)选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。(3)涉及到的微生物技术主要有：培养基的制作、无菌操作、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。(2010年青岛市模拟)啤酒是我们日常生活中最常见的饮料之一。生产过程大致如下：将经过灭菌的麦芽汁充氧，接入啤酒酵母菌菌种后输入发酵罐。初期，酵母菌迅速繁殖，糖度下降，酒精浓度渐渐上升，泡沫不断增多；当糖度下降到一定程度后，结束发酵；最后分别输出有形物质和啤酒。根据上述过程，回答以下问题：(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的
11、酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意添加_和调低pH，加琼脂后灭菌，制成固体平板。步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。步骤4：根据_筛选出突变菌。(2)上述步骤2、3的目的分别是_。(3)酿酒过程中，经检测活菌数量适宜但却不产生酒精，应采取的措施是_。(4)秸秆的主要成分为木质素、纤维素和半纤维素，但是酵母菌却无法直接利用，原因是其_。若要酵母菌能利用植物秸秆进行发酵抽取酒精，请提出解决该问题的方法。(列举两种方法)_。【解析
12、】(1)因为是选择耐高糖的酵母菌，所以应该加糖；一般来说能在选择培养基上生长繁殖的一定是耐高糖和耐酸的酵母菌。(2)步骤2的目的是创造选择的特定环境，步骤3的目的是通过稀释的方法期望获得单一菌落。(3)活菌数量较多但不能产生酒精说明酵母菌不能进行无氧呼吸，所以为了获得酒精必须密闭。(4)酵母菌缺乏分解纤维素的酶系所以不能利用纤维素，但是可以通过基因工程的方法将分解纤维素的微生物中有关基因导入酵母菌，或者混合培养等方式。【答案】(1)高浓度蔗糖(葡萄糖)是否能在选择培养基上生长(2)提供高糖和酸性筛选环境获得单菌落(3)隔绝空气(4)缺乏相应分解酶系(或缺乏纤维素酶和半纤维素酶)在酵母菌中转入分
13、解酶系相关基因；利用酶或微生物分解秸秆；利用物理和化学方法分解秸秆；将酵母菌与其他能分解秸秆的微生物混合发酵 (2009年宁夏高考题)(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应
14、保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。【解析】(1)影响微生物培养的因素除了营养条件外，外界条件主要包括温度、酸碱度和渗透压等。由于大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，所以常作为遗传学研究的实验材料。(2)灭菌是指用强烈的物理或化学的方法，杀死物体内外的一切微生物，包括芽孢和孢子。消毒指使用较为温和的物理
15、或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。对于培养基和培养器皿要进行灭菌，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒，静止空气中的细菌在用紫外线照射能够使蛋白质变性，并损伤DNA结构，使细菌死亡。(3)样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落的数目，实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数在30300之间。(4)菌落的特征是判断微生物的种类的重要依据。对获得的纯菌种可以依据菌落的特征对细菌进行初步检测。(5)要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下培养一段时间，若发现有菌落说明培养基已被污染。(6)进行微生物培养时，使用过的培养基及培养物必
16、须经灭菌后才能丢弃，防止培养的微生物扩散到环境中，造成危害。【答案】(1)温度酸碱度易培养生活周期短(2)灭菌消毒损伤DNA的结构(3)比例合适(4)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生(6)灭菌1(2009年四川高考题)下列关于几种微生物的营养代谢和生长繁殖的描述，正确的是()A根瘤菌通过生物固氮，制造了含氮养料和含碳有机物B接种到培养基上的青霉菌，进入对数期能大量积累青霉素C培养液中溶氧量的变化，会影响酵母菌的生长繁殖和代谢途径D用32P标记的噬菌体感染细菌，在新形成的噬菌体中都能检测到32P【解析】根瘤菌异养生活，不能合成含氮有机物
17、，A选项错误；处于对数期的青霉菌是菌种数目大量增加的时期，处于稳定期时才能积累大量青霉素，B选项错误；酵母菌的繁殖需要在有氧条件下进行，酵母菌在有氧和无氧条件下分别进行有氧呼吸和无氧呼吸，C选项正确；用32P标记噬菌体感染细菌时，其子代遗传物质的合成是以被32P标记噬菌体的DNA为模板，以细菌的核苷酸为原料，所以子代噬菌体中只有少数含32P，D选项错误。【答案】C2(2009年重庆高考)下列有关大肠杆菌的叙述，正确的是()A大肠杆菌以复制方式进行繁殖，其拟核是一个环状DNA分子B在含葡萄糖和乳糖的培养基上，大肠杆菌首先利用乳糖作碳源C用大肠杆菌工程菌生产干扰素时，应及时添加核酸等生长因子D处于
18、对数期的大肠杆菌，常作为生产用的菌种和科研的材料【解析】大肠杆菌是一种细菌，以二分裂的方式进行繁殖；在含葡萄糖和乳糖的培养基上，大肠杆菌首先利用葡萄糖作能源，然后再利用乳糖；利用大肠杆菌作为工程菌生产干扰素时，不需要添加外源生长因子；处于对数期的大肠杆菌细胞代谢最旺盛，常作为生产用的菌种和科研的材料。【答案】D3(2009年安徽高考题)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时D
19、确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数【解析】采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。【答案】D4(2007年江苏高考卷)不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是()A氮源物质为该微生物提供必要的氮素B碳源物质也是该微生物的能源物质C无机盐是该微生物不可缺少的营养物质D水是该微生物的营养要素之一【解析】本题考查微生物的营养要素以及理解应用能力、判断能力。CO2可为自养型微生物提供碳源，但不能提供能源。【答案】B5下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是()A在缺乏生长
20、素的无氮培养基中的固褐固氮菌B在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌C在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌D在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒【解析】圆褐固氮菌是自生固氮细菌，因此可以在缺乏生长素的无氮培养基中的生长繁殖。破伤风杆菌是异养厌氧细菌，人体表皮擦伤部位是有氧的环境，破伤风杆菌不能生长和繁殖，酵母菌是异养型微生物，新配制的植物矿质营养液中缺少有机碳；禽流感病毒不能独立生活，只能寄生在活的细胞中，因此禽流感病毒不能在灭菌后的动物细胞培养液中生长繁殖。【答案】A6下列关于平菇培养的操作程序，正确的是()A配制牛肉膏蛋白胨培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养B配制牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌，接
21、种，培养C配制棉子壳培养基，接种，高压蒸汽灭菌，培养D配制棉子壳培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养【解析】培养平菇所用的培养基是棉子壳，具体的操作程序是：配制培养基，高压蒸汽灭菌，培养。【答案】D7通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出(多选)()A大肠杆菌B霉菌 C放线菌 D固氮细菌【解析】根据题意，固氮细菌的生长不需要从培养基上获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长；加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放
22、线菌，则可收获霉菌和酵母菌；加入酚的培养基使细菌和霉菌不能正常生长，而放线菌却能利用酚作原料合成自身的产物。【答案】DBC8(2008年广东高考)苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示：为土壤样品。请回答下列问题：(1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入作为碳源，中不同浓度碳源的培养基_(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用_法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于_；使用_法可以在上
23、获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？_。(3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？_。(4)实验过程中如何防止其他微生物的污染？_。【解析】题目中所筛选的细菌“只能”降解苯酚，故可采用以苯酚为唯一碳源的选择培养基筛选，含除苯酚外其他碳源的培养基作为对照。培养液中苯酚浓度下降的速度可反映该菌对苯酚的降解能力。严格灭菌、无菌操作可有效防止实验过程中的杂菌污染。【答案】(1)苯酚A平板菌落计数(活菌计数或菌落计数)(2)的培养基没有加入苯酚作为碳源，培养基中加入苯酚作为碳源稀释涂布平板法或平板划线采用固体平板培养细菌时要倒置培养以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株。一定时间后，测定培养液中苯酚含量(4)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作(答案合理即可)