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1、抗体检测技术与类风湿因子第1页，此课件共32页哦抗体检测技术抗体检测技术 免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术免疫酶技术 免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术 凝集反应凝集反应凝集反应凝集反应 沉淀反应沉淀反应沉淀反应沉淀反应 补体结合试验补体结合试验补体结合试验补体结合试验放射免疫测定放射免疫测定 蛋白印迹蛋白印迹蛋白印迹蛋白印迹 免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀 亲和力测定亲和力测定亲和力测定亲和力测定 第2页，此课件共32页哦凝集反应l凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原
2、称为凝集原，抗体称为凝集素。第3页，此课件共32页哦沉淀反应1、絮状沉淀反应2、环状沉淀反应3、双向扩散4、单向免疫扩散第4页，此课件共32页哦l双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。第5页，此课件共32页哦抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。第6页，此课件共32页哦 酶联免疫吸附测定实验酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)Enzyme linked immun
3、osorbent assay 第7页，此课件共32页哦实验原理实验原理 ELISA ELISA ELISA ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体高度敏感性检测抗原或抗体1.1.1.1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性2.2.2.2.使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗使抗原或抗体与
4、某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性3.3.3.3.按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应4.4.加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析析第8页，此课件共32页哦方法类型方法类型ELISAELISA既可测抗原又可测抗体，根据试既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标
5、本性状以及检测的具体条件，可剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法：设计出不同类型的检测方法：1.1.直接法直接法 2.2.间接法间接法 3.3.双抗体夹心法双抗体夹心法 4.4.双夹心间接法双夹心间接法第9页，此课件共32页哦第10页，此课件共32页哦第11页，此课件共32页哦第12页，此课件共32页哦lA sandwich ELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibody
6、isadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.第13页，此课件共32页哦一、试剂及仪器准备一、试剂及仪器准备（一）（一）免疫吸附剂免疫吸附剂1.固相载体固相载体 要求：要求：吸附力强吸附力强 能保持能保持Ag或或Ab活性活性 不参与化学反应不参与化学反应 第14页，此课件共32页哦 载体性能比较载体性能比较 要求要求：载体材料载体材料+
7、、-结果差别大结果差别大结果差别大结果差别大 检测方法检测方法：10ug/L IgG10ug/L IgG包被包被包被包被,加酶标抗加酶标抗加酶标抗加酶标抗IgGIgG，显色后，显色后，显色后，显色后，测测测测20孔的孔的ODOD，要求，要求CV10%常用载体：常用载体：材料材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等等 形状形状：小试管、小珠、微量反应板小试管、小珠、微量反应板第15页，此课件共32页哦2.Ag或或Ab：纯度高、效价高、结合力高纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂免疫吸附剂(固相固相Ag或或Ab)：l 包被包被：将将Ag或或Ab固相化的过程固相化的过程 包被缓冲
8、液包被缓冲液l 封闭封闭：包被后在用包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰以消除非特异吸附的干扰第16页，此课件共32页哦 酶结合物：酶结合物：1.要求：要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定源丰富、标记后稳定源丰富、标记后稳定源丰富、标记后稳定2.常用酶常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶等 3.底物：底物：lHRPHRP可溶性底物及呈色：可溶性底物及呈色：邻苯二胺邻苯二胺(O
9、PD)(OPD)：橙红：橙红(492nm)(492nm)；四甲基联苯胺；四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：蓝色：蓝色(450nm)(450nm)5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-ASA)(5-ASA)：棕色：棕色(550nm)(550nm)鲁咪诺鲁咪诺+H2O2+H2O2：荧光：荧光lHRPHRP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色：DABDAB：棕黄色：棕黄色 -萘酚：红色萘酚：红色 3-3-氧基氧基-9-9-乙基卡唑：红色乙基卡唑：红色 4-4-氯氯-1-1-萘酚：灰蓝萘酚：灰蓝色色lAPAP可溶性底物及呈色：可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(P-NPP)(P-NPP)：黄
10、色：黄色(405nm)4-(405nm)4-甲基伞基磷酸酯甲基伞基磷酸酯(4-MuP)(4-MuP)：荧光：荧光lAPAP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色：NBTNBT和和BCIPBCIP混合液：紫色混合液：紫色 坚固红和萘酚坚固红和萘酚ASMXASMX混合液：红色混合液：红色l -半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：4-4-甲基伞基甲基伞基-半乳糖苷：荧光半乳糖苷：荧光第17页，此课件共32页哦4.酶结合物的制备：酶结合物的制备：l 戊二醛交联法戊二醛交联法l 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法第18页，此课件共32页哦（三）设备：（三）设备：（三）设备：（三）设备：酶标比色仪酶标比色仪简称简称酶标仪酶
11、标仪 l l指测读指测读指测读指测读ELISAELISAELISAELISA光度计；针对固相载体形式的不同，各有光度计；针对固相载体形式的不同，各有光度计；针对固相载体形式的不同，各有光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计特制的适用于板、珠和小试管的设计特制的适用于板、珠和小试管的设计特制的适用于板、珠和小试管的设计l l 性能指标性能指标性能指标性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性和可测范围、线性和可测范围、线性和可
12、测范围、线性l l 优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确0.0010.0010.0010.001，准确性为，准确性为，准确性为，准确性为1%1%1%1%，重复性达，重复性达，重复性达，重复性达0.5%0.5%l操作操作：室温宜在：室温宜在15-3015-3015-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-30min15-30min15-30min15-30min，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读，测读结果更稳定。测读A A A A值时，要
13、选用产物的敏感吸值时，要选用产物的敏感吸值时，要选用产物的敏感吸值时，要选用产物的敏感吸收峰，如收峰，如收峰，如收峰，如OPDOPDOPDOPD用用用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测波长。有的酶标仪可用双波长式测波长。有的酶标仪可用双波长式测波长。有的酶标仪可用双波长式测读读读读第19页，此课件共32页哦第20页，此课件共32页哦用途lDrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohnesdis
14、ease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:ldetectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisldetectionofrotavirusinfecesldetectionofhepatitisBmarkersinserumldetectionofenterotoxinofE.coliinfeces第21页，此课件共32页哦WESTERNBLOTl步骤：l试剂准备：l1、SDS-PAGE试剂:见电泳实
15、验。l2、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。l3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。l4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。l5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。l6、显色液：DAB6.0m
16、g；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0l。第22页，此课件共32页哦l样品制备l含量测定第23页，此课件共32页哦lSDSPAGE电泳第24页，此课件共32页哦l转膜第25页，此课件共32页哦l免疫反应第26页，此课件共32页哦l化学发光第27页，此课件共32页哦类风湿因子l类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）可分为IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在临床内科学中描述为四型，没有IgD型；但在实验室诊断学中描述为5型），是类风湿关节炎血清中针对IgGFC片段上抗原表位的一类自身抗体，类风湿因子阳性患者较多伴有关节外表现，如皮下结节及血
17、管炎等。第28页，此课件共32页哦类风湿因子l约90%类风湿性关节炎（RA）患者的RF呈阳性。lIgA-RF与骨质破坏有关，早期IgA-RF升高常提示病情严重，预后不良；IgE-RF升高时，已属病情晚期。l某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、SLE等患者都有较高的阳性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出现RF。第29页，此课件共32页哦类风湿因子l近年来对IgM型类风湿因子的生物作用已有所了解，这些生物作用包括：l1、调节体内免疫反应；l2、激活补体，加快清除微生物感染；l3、清除免疫复合物使机体免受循环复合物的损伤。第30页，此课件共32页哦类风湿因子l测定IgG、IgA、IgM类RF通常用ELISA间接法，即用热凝集兔IgG包被反应板微孔，加入检样后，再分别加抗人IgG、IgA、IgM酶标记抗体，使反应后再与底物呈色。为防止各Ig类别RF相互干扰，酶标记抗体使用标记的抗体F（ab）2片段。第31页，此课件共32页哦类风湿因子lRF因子浓度的检测对自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、结缔组织病、硬皮病等的诊断治疗和预后有重要的指导意义。另外，在慢性炎性反应性疾病中，因炎性反应对免疫系统造成的长期反复的刺激，引起免疫系统紊乱，也可导致RF浓度的升高，如慢性活动性肝炎患者等。第32页，此课件共32页哦