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1、关于高效液相色谱法 PPT现在学习的是第1页，共34页216-1 高效液相色谱法的特点1.特点：高压、高效、高速、自动化 与气相色谱比较：n适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样，离子型化合物和高聚物的分离分析。n液体流动相参与分离过程，选择性高。n固定相类型多，分析选择余地大。n较低的柱温，有利于色谱分离。n液体扩散性小，纵向扩散可忽略。n试样易于制备及回收。n仪器复杂昂贵。现在学习的是第2页，共34页n 液相色谱高柱效的原因:以特殊方法用小粒径的填料（35um球形）制备色谱柱n H=He+Hd+Hm+Hs+Hsm=A+B/u+Cmu+Csu+Csmu 由于溶质分子在溶剂中的扩散系数
2、很小，纵向扩散可以忽略。因此B项可以略去。n H=A+（Cm+Cs+Csm）unA=2dpn 2.液相色谱中速率理论0.01 k2(1+k)2 Cm=dp2 Dm 现在学习的是第3页，共34页416-2 高效液相色谱仪流程及主要部件流程组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统现在学习的是第4页，共34页516-2-1 高压输液系统（1）高压输液泵n主要部件之一，压力：150350105 Pa。n为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。n应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性现
3、在学习的是第5页，共34页6(2)梯度淋洗装置内梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。梯度淋洗：在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们的比例，使流动相的强度、极性、pH或离子强度相应地变化，以提高分离效果，缩短分析时间的目的。现在学习的是第6页，共34页716-2-2 进样系统 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：现在学习的是第7页，共34页816-2-3 分离系统 柱体为直型不锈钢管，
4、内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。现在学习的是第8页，共34页916-2-4 检测器 a.紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。现在学习的是第9页，共34页10b.光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。现在学习的是第10页，共34页11c.示差折光检测器（differential refractive in
5、dex detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度、流速敏感、不能用于梯度洗脱；现在学习的是第1 1页，共34页12d.荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；现在学习的是第12页，共34页13高效液相色谱检测器UV荧光 示差折光 蒸发光散射信号 吸光度 荧光强度 折光率 散射光强流速影响 无 无 无 无温度影响 小 小 大 小检测限(
6、g/ml)10-1010-1310-710-9梯度洗脱 适宜 适宜 不宜 适宜细管径柱 难 难 难 适宜样品破坏 无 无 无 无通用型 否 否 是 是现在学习的是第13页，共34页14高效液相色谱的固定相和流动相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。现在学习的是第14页，共34页151.
7、表面多孔型固定相 基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规快速分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。2全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相.这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速分析。柱容量大，最大允许样品量是表面多孔型的5倍，特别适合复杂混合物分离及痕量分析.现在学习的是第15页，共34页16（二）流动相 流动相
8、对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对待测样品须具有合适的极性和较好的选择性。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。现在学习的是第16页，共34页17（2）
9、溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加501OOnm。（4）化学稳定性好。避免与样品或固定相发生反应或聚合。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。（6）试样在流动相中应有适宜的溶解度，
10、若试样组分的分配比K值范围很广，则采用梯度洗脱。现在学习的是第17页，共34页18一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱五、排阻色谱六、亲和色谱(AC)主要分离类型与原理现在学习的是第18页，共34页1916-3 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附
11、常引起峰的拖尾；现在学习的是第19页，共34页2016-4 液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：（1）全多孔型载体（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）（3）固定液 极性：，-氧二丙腈，聚乙二醇 非极性：十八烷（ODS），角鲨烷 现在学习的是第20页，共34
12、页2116-5 化学键合相色谱bonded-phase chromatography1键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等.现在学习的是第21页，共34页22C18硅胶填料结构现在学习的是第22页，共34页2316-5 化学键合相色谱bonded-phase chromatography 2.化学键合固定相
13、特点：（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；适用于分离容量因子k值范围宽的样品。n 存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)n 高覆盖率：分配为主；n 低覆盖率：吸附为主；现在学习的是第23页，共34页243反相健合相色谱法 固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37、硅胶-苯基等；流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。多用于分离多环芳烃等低极性化合物；具有柱效高，能获得无拖尾色
14、谱峰的优点。分离机理：疏溶剂作用。把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。现在学习的是第24页，共34页254.正相键合相色谱法 固定相:极性的有机基团，CN、NH2双羟基等（表16-4）键合在硅胶表面；流动相:而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯
15、仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。5.离子性键合相色谱法 固定相:当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3）等；流动相:一般采用缓冲溶液。分离原理与离子交换色谱类同。现在学习的是第25页，共34页2616-6 离子交换色谱ion-exchange chromatography 流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离
16、子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。现在学习的是第26页，共34页27离子交换色谱分离固定相 结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别（表16-6）：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）现在学习的是第27页，共34页2816-7 排阻色谱色谱size-exclusion chr
17、omatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散（渗透）到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 现在学习的是第28页，共34页29 空间排阻分离固定相（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；
18、化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。现在学习的是第29页，共34页3016-8 亲和色谱(AC)Affinity chromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。现在学习的是第30页，共34页31分离类型 分离类型 分离原理 分离原理 固定相 固定相 流动相 流动相 应用对象 应用对象
19、液 液-固吸附色谱 固吸附色谱 固定相上吸附解 固定相上吸附解吸 吸硅胶、氧化铝等 硅胶、氧化铝等固体吸附剂 固体吸附剂不同极性的一 不同极性的一元或多元 元或多元溶剂。溶剂。不同官能团的化 不同官能团的化合物和异构 合物和异构体 体液 液-液分配色谱 液分配色谱 在固定相和流动 在固定相和流动相上分配 相上分配多孔型载体 多孔型载体+极 极性或非极性 性或非极性固定液 固定液与固定液极性 与固定液极性相反 相反分析各种不同性 分析各种不同性质的物质 质的物质化学键 化学键合相色 合相色谱 谱反相健合 反相健合与固定相缔合、与固定相缔合、解缔作用 解缔作用硅胶键合非极性 硅胶键合非极性固定相
20、固定相甲醇、乙睛 甲醇、乙睛-水、水、缓冲溶液 缓冲溶液等 等分离同系物、多 分离同系物、多环芳烃等 环芳烃等正相健合 正相健合 在固定相和流动 在固定相和流动相上分配 相上分配硅胶键合极性固 硅胶键合极性固定相 定相非极性或极性 非极性或极性小的溶剂 小的溶剂分离异构体，极 分离异构体，极性不同的化 性不同的化合物 合物离子健合 离子健合 反复离子交换反 反复离子交换反应 应硅胶键合离子交 硅胶键合离子交换基团 换基团缓冲溶液 缓冲溶液 离子化合物或有 离子化合物或有机酸碱 机酸碱离子交换色谱 离子交换色谱 反复离子交换反 反复离子交换反应 应载体表面涂覆离 载体表面涂覆离子交换树脂 子交换
21、树脂酸或碱溶液 酸或碱溶液 离子化合物或有 离子化合物或有机酸碱、生 机酸碱、生物物质 物物质排阻色谱色谱 排阻色谱色谱 按分子大小分离。按分子大小分离。凝胶 凝胶(具有一定 具有一定大小孔隙分 大小孔隙分布 布)缓冲液或有机 缓冲液或有机溶剂 溶剂大分子物质、测 大分子物质、测量相对分子 量相对分子量 量现在学习的是第31页，共34页3216-9 色谱分离方法的选择现在学习的是第32页，共34页33HPLC的应用 application of HPLC 1.环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50 m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm 2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。现在学习的是第33页，共34页2023/5/4感谢大家观看现在学习的是第34页，共34页