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1、第一章第一章 核酸的分子结构、性质和功能核酸的分子结构、性质和功能第一节第一节 DNA的结构与功能的结构与功能第二节第二节 RNA的结构与功能的结构与功能第三节第三节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交第四节第四节 反义核酸及药物反义核酸及药物第五节第五节 RNA干扰干扰1869年，年，F.Miescher从从脓细胞中提取到一种脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化富含磷元素的酸性化合物。合物。称核素称核素(nuclein)一、核酸的种类和分布一、核酸的种类和分布l核酸有两大类：核酸有两大类：DNA 和和RNAlDNA分布的主要场所：细胞核，线粒体，叶绿体分布的主要场所：细胞核，线粒体，叶绿体lRNA
2、分布的主要场所：细胞核，细胞质分布的主要场所：细胞核，细胞质l细胞生物中细胞生物中DNA 和和RNA 均有均有l病毒体内则只含有病毒体内则只含有DNA 或或RNA二、核酸是主要的遗传物质二、核酸是主要的遗传物质历史经典实验证明遗传物质是历史经典实验证明遗传物质是DNA而不是蛋白质而不是蛋白质1928年年 Griffith 肺炎球菌转化实验肺炎球菌转化实验1943年年Avery离体条件下完成转化离体条件下完成转化1952年年Hershey Chase噬菌体转导实验噬菌体转导实验一、一、DNA的一级结构的一级结构l lDNADNA的一级结构的一级结构是由是由4种脱氧核糖核苷酸即：腺嘌种脱氧核糖核苷
3、酸即：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，通过呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，通过3，5，磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。聚体。第一节第一节 DNA的结构与功能的结构与功能DNA的一级结构的一级结构5355-3DNA的相对分子质量非常大，通常一个染色体的相对分子质量非常大，通常一个染色体就是一个就是一个DNA分子，最大的染色体分子，最大的染色体DNA可超过可超过108bp。bp,base pairb,base那么一种生物基因组有多大呢？那么一种生物基因组有多大呢？DNA分子量的表示方法分子量的表示方法C值值：一个物种单：一个物种单倍体的
4、染色体所含倍体的染色体所含的的DNA的量。的量。C值矛盾值矛盾：DNA含量含量与其结构和功能并不与其结构和功能并不一致，可能有的基因一致，可能有的基因种类远大于实际所需种类远大于实际所需的的DNA含量。含量。为了阐明生物的遗传信息，首先要测定生物基因组的序列。为了阐明生物的遗传信息，首先要测定生物基因组的序列。迄今已经测定基因组序列的生物数以百计，其中包括病迄今已经测定基因组序列的生物数以百计，其中包括病毒、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和拟南芥菜、玉米、毒、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和拟南芥菜、玉米、水稻和人类基因组。水稻和人类基因组。Genome sizeGene number基因组大小实际上
5、就是它的基因组大小实际上就是它的C值值DNA的二级结构就是指两条脱氧核苷酸链反向平行的二级结构就是指两条脱氧核苷酸链反向平行排列所形成的双螺旋结构排列所形成的双螺旋结构右手螺旋，右手螺旋，A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA左手螺旋，左手螺旋，Z-DNA双螺旋双螺旋碱基倾角碱基倾角/o碱基间距碱基间距/nm大沟和小沟大沟和小沟每轮碱每轮碱基数基数螺旋方螺旋方向向A-DNA200.26大沟窄，很深大沟窄，很深小沟很宽，浅小沟很宽，浅11右右B-DNA60.34大沟宽，深大沟宽，深小沟窄，很深小沟窄，很深10右右Z-DNA70.37大沟平坦大沟平坦小沟很窄，深小沟很窄，深12左左不同螺旋
6、形式不同螺旋形式DNA分子主要参数比较：分子主要参数比较：二、二、DNA的二级结构的二级结构关于关于DNA双螺旋的小沟和大沟双螺旋的小沟和大沟大沟大沟 宽宽小沟小沟 窄窄蛋白质的蛋白质的alpha螺旋螺旋1.B-DNA是活性最高的是活性最高的DNA构象，构象，B变成变成A仍有活性，仍有活性，但变成但变成Z，活性明显降低。，活性明显降低。2.双螺旋是动态的平衡，结构改变以适应行使不同的双螺旋是动态的平衡，结构改变以适应行使不同的功能。功能。说明：说明：三、三、DNA的三级结构的三级结构DNADNA三级结构三级结构三级结构三级结构是指是指DNA分子通过扭曲和折叠分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象。
7、包括不同二级结构单元所形成的特定构象。包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用及互作用及DNA的拓扑特征。的拓扑特征。超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋是三级结构的一种形式。是三级结构的一种形式。拓扑结构拓扑结构 见见p9l就是指在就是指在DNA双螺旋的结构基础上，双螺旋的结构基础上，DNA进异步扭曲进异步扭曲形成的特定的空间结构。超螺旋是其主要的形式。超形成的特定的空间结构。超螺旋是其主要的形式。超螺旋又有正和负之分。螺旋又有正和负之分。l负超螺负超螺DNA易于解链。易于解链。DNA的复制、重组和转录等过的复制、重组和转录等过程都需将两条链
8、解开，因此负超螺旋有利于这些功能程都需将两条链解开，因此负超螺旋有利于这些功能的进行，但这些过程需要的需要的负超螺旋程度是各的进行，但这些过程需要的需要的负超螺旋程度是各不相同的，可以通过不相同的，可以通过DNA的拓扑结构来调节其功能的拓扑结构来调节其功能拓扑异构酶拓扑异构酶lDNA的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶(topoisomerase)来实现的。来实现的。四、四、Triplex（三股螺旋）（三股螺旋）Hoogsteen于于1963年描述了三年描述了三股螺旋结构。股螺旋结构。l第三股碱基可与第三股碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱
9、形成碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对；配对；l第三股与寡嘌呤核苷酸之间同第三股与寡嘌呤核苷酸之间同向平行；向平行；l第三股可来自分子间也可来自第三股可来自分子间也可来自分子内。分子内。RNA的一级结构的一级结构RNA的二级结构的二级结构 l分子内的局部双链分子内的局部双链 图图tRNARNA的三级结构的三级结构ltRNA 三叶草三叶草 倒倒LlrRNA的高级结构的高级结构l其他其他RNA高级结构高级结构 核酶：锤头型、发夹型等核酶：锤头型、发夹型等第二节第二节 RNA的结构与功能的结构与功能一、一、RNA的结构的结构RNA 的一级结构的一级结构RNA 的二级结构的二级结构RNA 的二
10、级结构的二级结构二、二、RNA的功能的功能lmRNAltRNAlrRNA 细菌细菌rRNA有有5S、16S、23S三种；三种；哺乳动物哺乳动物rRNA有有5S、5.8S、18S、28S四种四种lsRNA snRNA 核小核小RNAscRNA 胞浆胞浆RNA 通常与蛋白质结合形成核糖核蛋白通常与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒（颗粒（RNP），），U-snRNPl对基因表达和细胞功能有调节功能的对基因表达和细胞功能有调节功能的RNAmiRNARNAi RNA干扰干扰 一、核酸的变性和复性一、核酸的变性和复性核酸的变性核酸的变性（denaturation）是指核酸双螺旋氢键的断）是指核酸双螺旋氢键的断
11、裂，变成单键并不涉及共价键的断裂。共价键的断裂裂，变成单键并不涉及共价键的断裂。共价键的断裂是核酸的降解是核酸的降解.将将DNA双螺旋失去一半时的温度称为该双螺旋失去一半时的温度称为该DNA的的Tm（melting temperature）第三节第三节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 p15复性（复性（renaturation）变性变性DNA在适当的条件下又可使两条彼此分开的链在适当的条件下又可使两条彼此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构的过程称为自发重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性复性复性复性。变性变性DNA在缓慢冷却时可以复性，称为在缓慢冷却时可以复性，称为退火退火退火退火核酸的变性和复
12、性在基因工程中有何应用？核酸的变性和复性在基因工程中有何应用？已经复性的已经复性的DNA分子如果两条链来源不同，就分子如果两条链来源不同，就叫叫杂交分子杂交分子杂交分子杂交分子核酸的杂交核酸的杂交核酸的杂交核酸的杂交（hybridization hybridization）序列互补的单链序列互补的单链RNA和和DNA，或，或DNA和和DNA，或，或RNA和和RNA，根据碱基互补的原则，借助氢键相连而形成，根据碱基互补的原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程双链杂交分子的过程二、核酸分子杂交的基本原理二、核酸分子杂交的基本原理探针探针探针探针probe:probe:是一段可以与靶核酸序列特异
13、结合发是一段可以与靶核酸序列特异结合发生相互作用的核酸序列，经过标记后可以用来检测生相互作用的核酸序列，经过标记后可以用来检测出靶核酸序列出靶核酸序列探针的性质：探针的性质：DNA，RNA，双链或单链均可，双链或单链均可探针的长度：从探针的长度：从20bp到几到几kb都可以都可以探针的标记：同位素或非同位素探针的标记：同位素或非同位素三、核酸探针及标记三、核酸探针及标记1.Southern blotSouthern blot l1975英国分子生物学家发明的英国分子生物学家发明的DNA 印迹方法印迹方法l检测检测DNA2.Northern blotNorthern blot l1977年年 A
14、lwine 建立建立Thonas 改进改进 的的RNA 印迹方法印迹方法l检测检测RNA3.Western blotWestern blotl以亲和或免疫反应检测蛋白的蛋白质印迹方法以亲和或免疫反应检测蛋白的蛋白质印迹方法四、核酸分子杂交的应用四、核酸分子杂交的应用Southern Blot4.hybridization in situ 原位杂交原位杂交l在组织或细胞水平上使用标记探针与细胞内在组织或细胞水平上使用标记探针与细胞内DNA或或RNA杂交的方法杂交的方法5.其他形式的杂交其他形式的杂交l如斑点杂交如斑点杂交,狭缝杂交狭缝杂交,菌落杂交菌落杂交,噬菌斑杂交噬菌斑杂交,本质还是本质还是
15、Southern or Northern blot6.BiochipBiochip生物芯片生物芯片生物芯片生物芯片 来源于微阵列技术来源于微阵列技术来源于微阵列技术来源于微阵列技术(Microarray)(Microarray)生物芯片生物芯片生物芯片生物芯片：将数以万计的生物大分子探针分别固定：将数以万计的生物大分子探针分别固定在微小载体表面而制成的芯片。目前有蛋白质芯在微小载体表面而制成的芯片。目前有蛋白质芯片和核酸芯片两类。片和核酸芯片两类。原理原理:核酸或蛋白质之间的杂交核酸或蛋白质之间的杂交1998年世界十大科技进展之一年世界十大科技进展之一第四节第四节 反义核酸及药物反义核酸及药物
16、p18 （1 1）概念：）概念：）概念：）概念：反义核酸反义核酸反义核酸反义核酸是根据碱基互补的原理是根据碱基互补的原理,利用人工合成或细胞中天然存在的利用人工合成或细胞中天然存在的DNA或或RNA片段片段(或其化学修饰的衍生物或其化学修饰的衍生物)与目的靶序列核酸与目的靶序列核酸结合，通过空间位阻作用或诱导结合，通过空间位阻作用或诱导RNAase活性的活性的降解作用，在复制、转录、剪接、降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的靶基因的表及翻译等水平上，抑制或封闭目的靶基因的表达。达。反义核酸的功能主要取决于其稳定性、生物利反义核酸的功能主要取决于其稳定性、
17、生物利用度以及与靶基因结合或反应的特性。用度以及与靶基因结合或反应的特性。1.1.反义核酸反义核酸反义核酸反义核酸(antisense nucleic acid)（2）.反义核酸作用的靶区域反义核酸作用的靶区域mRNA5非翻译区非翻译区mRNA5编码区编码区mRNA5帽子形成位点区域帽子形成位点区域前体前体mRNA外显子与内含子结合部位外显子与内含子结合部位mRNA polyA形成位点区域形成位点区域阻止阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运的成熟及其向胞浆中的转运 反义技术反义技术是利用人工合成或细胞中天然存在是利用人工合成或细胞中天然存在的的DNA或或RNA片段片段(或其衍生物或其衍生物)与
18、特定的基与特定的基因相互作用因相互作用,从而抑制基因的表达。目前发从而抑制基因的表达。目前发展到第三代。展到第三代。第一代第一代 硫代修饰寡聚核苷酸硫代修饰寡聚核苷酸 第二代第二代 甲氧甲氧/乙氧基反义寡核苷酸乙氧基反义寡核苷酸 第三代第三代 肽核酸（肽核酸（PNA）2.反义技术与药物反义技术与药物 20年来年来,反义核酸药物的发展非常缓慢反义核酸药物的发展非常缓慢,仅有一个反义仅有一个反义药物进入市场药物进入市场,惟一获得批准的惟一获得批准的RNA反义药物是反义药物是1998年年8月月27日得到美国日得到美国FDA正式批准的诺华、正式批准的诺华、Isis制药的制药的福米韦生（福米韦生（fom
19、ivirsen、Vitravene），该药主要用来），该药主要用来治疗艾滋病人的巨细胞病毒性视网膜炎。治疗艾滋病人的巨细胞病毒性视网膜炎。其他大部分都在其他大部分都在期临床试验中遭遇失败期临床试验中遭遇失败,有关反义新有关反义新药的申请也很快被药的申请也很快被FDA驳回。驳回。人们开始把目光投向竞争人们开始把目光投向竞争RNA技术平台尤其是小干扰技术平台尤其是小干扰RNA(siRNA)。这是否意味着反义核酸药物没有发展前途了呢这是否意味着反义核酸药物没有发展前途了呢?第五节第五节 RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）20022002年度年度ScienceScience
20、评选的评选的1010大科学成就中大科学成就中RNAiRNAi名列榜首名列榜首1998年诺贝尔奖年诺贝尔奖从反向的角度为基因表达调控的研究，基因的功能从反向的角度为基因表达调控的研究，基因的功能分析提供了更好、更有效的手段分析提供了更好、更有效的手段 概念一：正义链和反义链概念一：正义链和反义链RNA组成的双链组成的双链RNA可有效抑制靶基因的表达，这种现象称为可有效抑制靶基因的表达，这种现象称为RNA干扰。干扰。概念二：概念二：RNA干扰是指在进化过程中高度保干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源）诱发的、同源
21、mRNA高效特异性降解高效特异性降解的现象。（来自于网络）的现象。（来自于网络）1.概念概念2.RNA干扰作用原理干扰作用原理 RNAi抑制基因表达方式：抑制基因表达方式：（1）与）与mRNA形成双链，形成双链，阻止蛋白与靶阻止蛋白与靶mRNA的的结合；结合；（2）促使目标）促使目标mRNA的的降解。降解。3种不同的种不同的survivin siRNA对对EJ28细胞增殖和凋亡的影响细胞增殖和凋亡的影响第三军医大学学报第三军医大学学报 2007/22目的目的观察靶向survivin的不同siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响。方法方法通过化学合成方法合成3对siRNA和1对荧光标记的阴性对照
22、siRNA。转染荧光标记的siRNA后,在荧光显微镜下观察转染效率。实验分为siRNA164、siRNA167、siRNA389、阴性对照组、脂质体对照组和细胞对照组。转染后24h、48h和72h,MTT法检测siRNA对EJ28细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。结果结果 靶向survivin的序列特异性siRNA均能抑制EJ28细胞的增殖,其中以siRNA164抑制细胞的增殖能力最强(P0.05),转染48h后的抑制率最高(41.322.54)%;转染48h后,siRNA164组凋亡率最高(13.200.25)%。结论结论 靶向survivin的RNAi技术在膀胱癌的基因治疗中可能具有一
23、定的价值 文献选读文献选读3.microRNA或或miRNA，小，小RNAMicroRNAs(miRNAs)是一种大小约是一种大小约2123个碱基的个碱基的单链小分子单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约是由具有发夹结构的约70-90个碱基个碱基大小的单链大小的单链RNA前体经过前体经过Dicer酶加工后生成。酶加工后生成。最早被发现的两个最早被发现的两个miRNAslin-4 and let-7被认为是通过被认为是通过不完全互补结合到目标靶不完全互补结合到目标靶mRNA 3非编码区非编码区端，以一种未知方端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成。式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制
24、蛋白质合成。多个果蝇多个果蝇miRNA也被发现和他们的目标靶也被发现和他们的目标靶mRNAs的的3非编非编码区有部分同源。由于码区有部分同源。由于miRNA和其潜在的目标靶之间并非完和其潜在的目标靶之间并非完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定全互补，这使得通过信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点的目标靶位点变得困难。变得困难。MiRNA的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。关注热点。MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis.Cell R
25、esearch(2008)18:350-359.MicroRNAs(miRNAs)are a class of naturally occurring small non-coding RNAs that target protein-coding mRNAs by repressing translation or causing mRNA degradation.Mature miRNAs comprise about 22 nucleotides,derived from long transcripts pri-miRNAs and pre-miRNAs.Although miRNAs
26、 operate in a similar fashion as short interfering RNAs(siRNAs)they typically target a cluster of genes instead of one specific gene.It is predicted that an average miRNA can have more than 100 targets.Emerging evidence demonstrates an important role of miRNAs in regulating diverse cellular processe
27、s including differentiation,proliferation and apoptosis.Deregulation of miRNAs affects normal cell growth and development,leading to a variety of disorders including human malignancies.Of particular interest,the overall miRNA expression profile of normal tissues is distinct from that of tumor tissue
28、s.Specific sets of miRNAs may serve as biomarkers to predict clinical outcomes.miRNAs can function as tumor suppressors or oncogenes,depending on whether they specifically target oncogenes or tumor suppressor genes.In this regard,tumor suppressive miRNAs are usually under expressed in tumors.For instance,let-7,mir-15 and mir-16 are downregulated or deleted in lung cancer and leukemia.By contrast,oncogenic miRNAs,such as mir-21 and mir-155,are overexpressed in tumors or tumor cell lines.关于RNA反义技术应用？RNA反义药物三朵金花：反义RNA，siRNA和miRNAl科学研究l临床应用