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1、第 2课时 微生物的培养技术及应用【课标要求】L获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。考点一微生物的培养技术及应用梳理归纳夯实必备知识1 .培养基的配制(1)概念：人们按照微生物对萱养物质的不同需求，配制出供其生氐繁殖的营养基质。(2)用途：用以培养、分离、鉴定、保存
2、微生物或积累其代谢物。(3)类型：按物理状态分类培养基种类特点用途液体培养基不含凝固剂,呈液体状态工业生产固体培养基含凝固剂(如琼脂),呈固体状态微生物的分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏(4)成分成分含义作用来源碳源提供碳元素的物质构成牛.物体的细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质无机碳源:c o2.N a H C O：,等；有机碳源：糖类、牛肉膏等氮源提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸等物质无机氮源：N2 N H：,、钱盐、硝酸盐等；有机氮源：蛋白陈等无机盐为微生物提供除碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素为微生物提供无机营养，调节培养基的p H 等无机化合物：K H
3、SPOK KJIPOK N a C l等水生物体含量最高的无机化合物良好的溶剂，参与化学反应等培养基、代谢产物提醒除了上述主要营养物质外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。例如，在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素;在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性;在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性:在培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。2.无菌技术(D 目的：获得纯净的培养物。(2)关键：防止杂菌污染。(3)区别：消毒与灭菌的比较比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理、仅杀死物体表面或内部一部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药
4、物消毒法操作空间、操作化学或生 者的衣物和手等物等方法紫外线消毒法接种室、接种箱或超净工作台灭菌强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽抱和抱子湿热灭菌法培养基、容器等干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等灼烧灭菌法接种工具等提醒选择无菌技术的原则：一要考虑无菌技术的效果，灭菌的效果比消毒要好；二要考虑操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能用灭菌。(4)其他操作做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。教材隐性知识源于选择性必修3Pi。“相关信息”：
5、生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。3.微生物的纯培养(1)概念辨析(悭 关 物L接种于培养基内，在合适条件下形成堵 养 物厂的含特定种类微生物的群体(纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体分散的微生物在适宜的固体培养基表(菌 落 卜 面或内部繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体(纯 培 养 卜 获得纯培养物的过程(2)酵母菌纯培养的操作步骤配制培养基：称取去皮的马铃智2 0 0 g、切块 一加水1 0 0 0 mL、加热煮沸一纱布过滤一加2 0 g 葡萄糖一加1 5 2 0 g 琼脂一用蒸锵水定容至1 00()m L(a.培养基灭菌：湿热灭菌(高压蒸
6、汽灭菌)法灭菌-l b.培养皿灭菌：干热灭菌法a.条件：待培养基冷却到5 0 t左右时，在酒精灯火焰附近倒平板c.I、H、I I I 中的灭菌方法是灼烧灭菌d.I V 中的操作需要等待平板冷却凝固 后才能进行J接 种 和 方 法：平板划线法分离 I原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面经数次划线后培养,可以分离得到单菌落 方法：将接种后的平板和一个未接种的平板倒置,放入恒温培养箱中培养培养酵.母 菌 条件：邺 t左右.时间：2 4-4 8 h请思考以下问题：平板冷凝后，要将平板倒置的原因是什么？提 示 因 为 平 板 冷 凝 后，皿盖上会凝结水珠
7、，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)平板划线法操作步骤在火焰旁冷却接种环,同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红将试管口通过火焰，并塞上棉塞在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖灼烧接种环，待其冷却后,从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。据图思考以下问题：a.第二次
8、及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，这样做的目的是什么？提示能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物。b.操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的填写下表：项目第一次操作每次划线之前划线结束目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者C.平板划线时最后一次划线为何不能与第一次划线相连？提示 最后一次划线己经将酵母菌稀释成单个细胞，如果与第一次划
9、线相连，则增加了酵母菌数目，得不到纯化的效果。考向突破强化关键能力考向一培养基与无菌技术1 .无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中正确的是（）A.紫外线照射前，适量喷洒石炭酸等消毒液，可以加强消毒效果B.牛奶的消毒常用紫外线消毒法C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D.在微生物接种的实验中，用9 5%酒精对实验者的双手和超净工作台进行消毒答 案A2 .请回答下列与大肠杆菌有关的问题：（1）下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。成分蛋白陈乳糖蔗糖K2HPO4显色剂琼脂含量1 0.0 g5.0 g5.0 g2.0 g0.2 g1 2.0 g将上达二 物质溶解后，用蒸
10、镭水定容到1 0 0 0 m L该培养基属于（填“固 体”或“液 体”）培 养 基，该 培 养 基 中 的 氮 源 是（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需 对 培 养 基 和 培 养 皿 进 行（填“消毒”或“灭菌”）；操 作 者 的 双 手 需 要 进 行 清 洗 和。（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管扎成一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌，温 度 为1 2 1,时 间 为1 5 3 0 m i n。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到大气压时，将试管取出。（4）从一支试管向另一支试管接种时应注意，接种环要在酒精灯（填“火焰的不充分燃烧层”或“火焰的充分
11、燃烧层”）灭菌，并且待接种环 后蘸取菌种。答 案（1）固 体 蛋 白 陈（2）灭 菌 消 毒（3）高 压 蒸 汽 灭 菌 锅（4）火 焰 的 充 分 燃 烧 层 冷却考 向 二 微生物 的 纯 培 养3 .如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1-2-3-4-5,下列说法正确的是（）A.操作前要将接种环用酒精消毒B.划线操作须在酒精灯火焰附近进行C.只有在5区才可以得到所需菌落D.在 1、2、3、4、5区域中划线前后都不需要对接种环灭菌答 案 B解析在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在酒精灯火焰上灼烧,不能用酒精消毒；在 5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所
12、需菌落；每次划线前都要灼烧接种环，目的是杀死接种环上原有的微生物（第一次划线前）和上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，划线结束后灼烧接种环以防止污染环境和感染操作者。4.（2 0 2 2 山西高三适应考试）自然界里有多种微生物，将其进行合理的筛选、培养和应用，能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题：（1）对培养基进行灭菌时，多采取 法，而对接种环或涂布器灭菌时则用一法，若要将微生物采用平板划线法进行分离操作，在固体培养基表面连续进行了5次划线，则需要对接种环灼烧 次。平板划线在做第二次及其以后的划线操作时，要从上次划线的 一开始划线，最后一
13、次划的线不能与第一次划的线 o（2）将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中 培养，以减少培养基中水分的挥发。其中，培养未接种的固体培养基是为了答 案（1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）灼 烧 灭 菌 6 末 端 相 连（2）倒 置 作 为 对 照 组，检验培养基是否被杂菌污染考点二微生物的选择培养和计数梳理归纳1.区分选择培养基与鉴别培养基种类特点用途举例选择培养基允许特定种类的微生物生长,同 时 抑制或阻止其他种类微生物生长从众多微生物中分离所需的微生物加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌鉴别培养基根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而鉴别不同种类的微生物用伊红一
14、亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌产生特定的颜色或其他变化提醒 常见选择培养基举例：缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中用的微生物。含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。2.微生物的选择培养和数量测定(1)稀释涂布平板法步骤系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞,随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。操作步骤:无菌水涂布平板操作步骤涂布器取0.1 m L菌液滴加到培养基表面涂布器浸在盛有酒精的烧杯中将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时
15、可转动培养皿,使涂布均匀(2)微生物的数量测定方法显微镜直接计数法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，原理一在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量方法一用计数板计数缺点 不能区分死菌与活菌而使计数结果偏大间接计数法一一活菌计数法(即稀释涂布平板法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数=(C+V)xMC代表某一稀释 丫代表涂布平板 加代表稀度 下 平 板 上 生 长 时 所 用 的 稀 释 液 屋 仲 豺 的 平 均 菌 落 数|的体积(mL)|根据图示问
16、答以下问题:I,为了保证结果准确，一 般 选 择 菌 落数在 30300的平板进行计数。I【.为什么用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低？提 示 因 为 当 两 个 或 多 个 细 胞 连 在 一 起 时，平板上观察到的只是一个菌落。H I.某 同 学 在 稀 释 倍 数 为 IO,的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用 稀 释 液 的 体 积 为 0.1m L),那 么 稀 释 倍 数 为 IO,的试管中细菌的浓度是2.34X IO,个/m L,稀释 倍 数 为 10的锥形瓶中细菌的浓度为2.34X 10*个/m L,所以每克样品中的细菌数是2.34X比 个。
17、3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)实验原理土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成胭酶;配制以奥案为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌(2)实验流程土壤取样：从酸碱度接近中性的潮湿土壤中，铲去表层土，取距地表土老cm的土壤层样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300的平板适于计数产.接种：用稀释涂布平板法接种;微 生 b.培养条件：3()37七培养12天；物的培 c.观察：根据菌落的特征区分微生物;养 与 观 d.计数：每隔24小时统计一次菌落数目，选取察 I 菌落数日稳定时的记录作为结果计算：计算单位体
18、积中的菌体数(3)实验结果分析与评价有无杂菌污染的判断无 菌 落 生 长 一未被 柴 菌 污 染对照的培养皿中g菌 落 生 长 一 被 杂 菌 污 染培养基r选 择 培 养 基 上 的 菌 落 数 选 择 培 养是否具筛选作用目远少于牛肉膏蛋白陈一基具筛选.培养基上的菌落数目 作用重复组（比 较各_ _ 若选取同一种土样，统的结果 1重复组 计结果应接近样品稀r得到3个或3个以上菌落操作释评价,1数目在30 30 0的平板f成功 教材隐性知识选择性必修3P”“探究实践”：本活动初步筛选了能分解尿素的细菌，请进一步借助于生物化学的方法来鉴定所分离的菌种：分解尿素的细菌合成的胭酶可以将尿素分解成氨
19、，氨会使培养基的碱性增强，在培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该细菌能够分解尿素。考向突破考向一微生物的选择培养5.（2 0 2 1 江 苏 1 月适应性考试，1 4）稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是（）A.固体培养基灭菌后，应冷却至5 0 左右时倒平板B.倒好的平板需立即使用，以免表面干燥，影响菌的生长C.稀释涂布平板分离到的单菌落需进一步划线纯化D.稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数答 案 B解析培养基灭菌后需要冷却至5 0 C左右时才能用来倒平板，避免温度过高，A正确；倒好的平板需要放置一段时间，用以观察培养基是否被杂菌污
20、染，B错误；稀释涂布平板法分离的单菌落需要用平板划线法进行纯化培养，C正确；稀释涂布平板法可以计数，也可观察菌落特征进行菌种分离，D正确。6.营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种成长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种（不改变菌落位置）到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。影印接种.酵母菌菌落乙 丙。无菌落生长下列分析正确的是（）A.接种到甲培养皿采用的是平板划线法B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基C.甲培养皿
21、中菌落数有可能比接种的酵母菌数少D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落答 案 C解析甲培养皿的菌落均匀分布，接种方法应为稀释涂布平板法，A项错误：甲、丙培养基菌落数目多，包括野生型酵母菌菌株和某种营养缺陷型酵母菌菌株，乙培养皿没有生长的菌株是某种营养缺陷型酵母菌菌株，故乙培养皿的培养基是基本培养基，甲和丙生长了同样的菌株，则甲和丙是加入了同种生长因子的培养基，B项错误；由于基因突变具有不定向性，接种到甲培养皿的酵母菌可能还有其他营养缺陷型菌株，且有些菌落不一定由一个酵母菌形成，所以，甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少，C项正确；乙培养皿的培养基是基本培养基，形成的菌落只可能是野
22、生型菌落，D项错误。【归纳总结】两种纯化方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法分离结果卷关键操作接种环在固体培养基表面连续划线一系列的梯度稀释；涂布平板操作接种用具接种环涂布器优点可以观察菌落特征，对混合菌进行分离可以计数，可以观察菌落特征缺点不能计数操作复杂，需要涂布多个平板共同点都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征考向二微生物的分离和计数7.（2 0 2 0 全 国 1 ,3 7）某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验
23、过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水 和 S,乙的组分为无机盐、水、S和 Y。稀释涂 挑单菌接种 布平板 落接种第坦超重普生旦无 菌 水 甲 乙 甲多次筛 差 高 效 降、-解S的菌株回答下列问题：（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是。甲、乙培养基均属于 培养基。（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2 X 1 0/、/m L,若要在每个平板上涂布1 0 0 uL 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过2 0 0 个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。（3）在步骤的筛选过程中，发现当培养基中的S 超过某一浓度时，某菌株对S的降
24、解量反而下降，其原因可能是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _（答 出 点即可）。（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请
25、写出主要实验步骤：（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4 类营养物质，即答 案（1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）琼 脂 选 择（2）1 0 （3）S的浓度超过某一值时会抑制 菌 株 的 生 长（4）取淤泥加入无菌水中，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培 养 后 计 数（5）水、碳源、氮源和无机盐解 析（1）乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是可使液体培养基凝固的琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此是选择培养基。（2）设稀释倍数为4 1 m L2 0 0 个=1 0 0 0 U L,套用计算式：/I X =2 X 1 0,（t/m
26、L）,计算出/=1 0 。（3）在筛选降解S物质0.1 m L的细菌的过程中，如果培养基中的s浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对 S的降解量反而下降（或 者 S改变了培养基的p H,导致细菌代谢活性降低）。（4）测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中：用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；微生物培养与观察计数。重温高考真题演练1.（2 0 2 1 山东，1 4）解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌
27、菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是（）A.甲菌属于解脂菌B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力答 案 B解 析 根 据 题 干 信 息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A 项正确；乙菌菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B 项错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C 项
28、正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪醐的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D项正确。2.（2021 山东，20）含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁镀结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁镀的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（）穿刺路径二乙0(TI)甲A.乙菌的运动能力比甲菌强B.为不影响菌的运动需选用液体培养基C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染答 案 B解析 从图中可以
29、看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确：为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B 错误；该实验可以根据黑色沉淀的多少初步比较细菌产生硫化氢的能力，但不能测定产生硫化氢的量，C 正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。3.（2020 江苏，19）为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（）A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B.图中I、n区的细菌数量均太多，应从n i 区挑取单菌落C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色答 案 B解 析 温 度 降 低
30、 后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，i n 区开始出现单菌落，应从H I 区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。4.(2 0 2 0 江苏，3 1)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是一(填编号)。编号物品培养基接种环培养皿涂布
31、器灭菌方法高压蒸汽火焰灼烧干热臭氧(2)称 取 1.0 g 某土壤样品，转入9 9 m L无菌水中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 m L菌悬液涂布在固体培养基上，其 中 1 0 倍稀释的菌悬液培养后平均长出了 4 6 个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径_ _ _ _ _ _ _的菌落，纯化后获得A、B 两突变菌株。(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物
32、资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _5.O5。5o2zLLo.gQo)豆黑菌株A-脂 菌株B-细肪剩余 胞密菖飞 ，/：产晨菌株A-细yrJ菌株B-脂肪剩余I I I I I I I I I I I培养时间AJvr/Arl-186+20rI-11I-答 案（1
33、）（2）梯 度 稀 释 4.6 X 1 0,（或 4 6 0 0 0 0）（3）诱变 脂肪 较 大（4）B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好解 析（2）利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在3 0 3 0 0 个的平板最适于计数。0.1 m L菌悬液中含有4 6 个酵母菌落，则 1 m L菌悬液中含有4 6 0 个酵母菌落；1.0 g 土壤样品首先稀释1 0 0倍，然后稀释1 0 倍，共稀释了 1 0 0 0 倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌4 6 0 X 1 0 0 0=4.6 X1 0
34、个）。（3）采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪（碳源）多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪（碳源）少。（4）通过分析题图可知，相同时间内，菌株B 细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。五 分 钟 查 落 实一、易错辨析1 .消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害（V ）2 .倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培
35、养皿倒过来放置（X ）3 .倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上（X ）4 .为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落（X ）5 .分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低（X ）二、填空默写1 .（选择性必修3 P i o）培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源等。2 .（选择性必修3 PG获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还 能 有效避免操作者自身被微生物感染。3 .（选择性必修3 PG菌落是指分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一
36、定形态结构的子细胞群体。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。4 .（选择性必修3 PM）选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。5 .（选择性必修3 P J平板冷凝后，要将平板倒置的原因是平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以减少培养基中的水分过快地挥发,乂可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。6 .（选择性必修3 P G 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼
37、烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。7 .（选择性必修3 P i O 在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是以免接种环温度太高，杀死菌种。8 .（选择性必修3 P Q 在第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到
38、由单个细菌繁殖而来的菌落。9 .（选择性必修3 PM）当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。1 0 .（选择性必修3 P1 9）检测培养物中是否有杂菌污染的方法是同时培养灭菌后的未接种的培养基，观察是否有菌落产生。判断选择培养基是否起到筛选作用的方法是配制牛肉膏蛋白陈培养基作为对照，观察选择培养基上的菌落数是否远少于牛肉膏蛋白被培养基上的菌落数目。课时精练一、选择题1.（2 0 2 2 河北高三联考）下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是（）成分蛋白陈葡萄糖K2HPO4伊红亚甲蓝蒸储水含量1 0 g1 0 g2 g0.4 g0.0 6 5g
39、1 0 0 0 m LA.从物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白陈C.该培养基缺少提供无机盐的物质1）.该培养基调节合适的p H后就可以接种使用答 案 B2.在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列关于消毒和灭菌的叙述，错误的是（）A.牛奶的消毒常用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法B.水厂供应的自来水通常是经过高镭酸钾消毒的C.用紫外灯对密闭教室消毒前，适量喷洒消毒液可强化消毒效果D.培养基不能放入干热灭菌箱中进行干热灭菌答 案B解析高锯酸钾是强氧化剂，不宜用于自来水消毒，B项错误。3
40、.下列与微生物培养相关的说法错误的是（）A.平板上的一个菌落一般是由一个细胞繁殖而来的B.稀释涂布平板法对微生物计数时，欲 将1mL样品稀释10倍，应加入10mL无菌水C.平板划线法接种微生物后，将平板倒置放入培养箱中，防止冷凝水倒流污染培养基D.制作牛肉膏蛋白陈固体培养基时，应将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯中再加水去纸答 案B解析 稀释涂布平板法对微生物计数时，欲 将1疝样品稀释10倍，只需加入9mL无菌水，B错误。4.养殖池中存在的有毒物质主要是氨和亚硝酸，这两种物质可由硝化细菌吸收利用。研究人员从养殖池池泥中分离出硝化细菌并进行了计数。下列有关叙述正确的是（）A.需配制一定浓度含氨
41、盐的牛肉膏蛋白陈培养基以分离硝化细菌B.配制的培养基经高压蒸汽灭菌后通常还需要调节pH才能使用C.涂布时，用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面D.使用稀释涂布平板法统计得到的菌落数目往往比活菌的实际数目少答 案D解析硝化细菌属于自养型生物，因此培养硝化细菌的培养基中不需要加入有机碳源，则培养基中不能加入牛肉膏蛋白陈，A错误；培养基制备过程中应先调节pH,再经过高压蒸汽灭菌，B错误；用滴管或移液管取少量菌液滴到培养皿上，然后用经过灭菌的涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，C错误；用稀释涂布平板法统计菌落数目时，由于当两个或多个细菌连在一起时形成一个菌落，这样统计的菌落数往往比活菌的实际
42、数目少，D正确。5.培养基可为微生物的生长、繁殖提供必需的营养物质。根据某些微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理设计培养基，可使其具有只允许特定的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。下列关于选择培养基的说法，错误的是（）A.培养基中添加伊红一亚甲蓝，统计饮用水中大肠杆菌的数量B.以尿素为唯一氮源的培养基，可将土壤中的尿素分解菌筛选出来C.培养基中添加青霉素从而将真菌从混有细菌的培养基上选择出来D.用以纤维素为唯一碳源的培养基分离出分解纤维素的微生物答 案 A解析大肠杆菌的代谢产物能与伊红一亚甲蓝发生特定的颜色反应，使菌落呈深紫色，但该方法不能统计大肠杆菌数目，只能鉴别大肠
43、杆菌的有无，A项错误。6 .尿酸氧化酶能分解尿酸（C s H N Q。，为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从海洋泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到1 0 6,然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活力（用每分钟转化1 um o l 尿酸所需要的酶量表示），结果如下表所示。下列分析错误的是（）菌株1234酶活力1 0 05 01 42 0A.从海洋泥土中取的样品需在无菌条件下富集培养B.需要在以尿酸为唯一氮源的固体培养基上分离培养C.菌株3的酶活力最高，可作为实验所需的目的菌D.分离培养时利用了平板划线法进行接种答 案 D解析为
44、获得纯净培养物，避免杂菌污染，应进行无菌操作，A项正确；实验目的是为获取尿酸氧化酶高产菌株，故需要在以尿酸为唯一氮源的固体培养基上分离培养，B项正确；酶活力用每分钟转化1 口 m o l 尿酸所需要的酶量表示，故所需酶量越少，说明酶活力越高，可知菌 株 3的酶活力最高，可作为实验所需的目的菌，C项正确：根据题意可知，分离培养时利用了稀释涂布平板法进行接种，D项错误。7 .（2 0 2 2 宁波市高三适应性考试）下图为分离以尿素为氮源的微生物的实验结果，下列叙述正确的是（）稀释 稀释 稀释 稀释度 10 度 10-；度 10T 度 10-5A.图中采用平板划线法接种B .图中和表示尿素培养基长出
45、的菌落C.图中培养基中菌落生长代谢时，会释放C O?D.实验结果表明，自然界中能合成胭酶的微生物比例较高答 案 C解析根据实验结果可知，图中采用的接种方法为稀释涂布平板法，A项错误；由图中和的菌落的特征可知，稀释度为1 0-6 的菌落数明显多于稀释度为1 0-7 时的菌落数，很可能是由于杂菌污染导致的结果，而不是分离出以尿素为氮源的微生物，B项错误；已经分离出单个细菌繁殖而来的尿素分解菌的菌落，尿素分解菌含有胭酶，能够催化尿素分解成氨、二氧化碳和水，C项正确；根据实验结果，无法判断自然界中能合成腺酶的微生物比例,D项错误。8.某同学将1 m L 土壤样液稀释1 0 0 倍，在3个平板上用稀释涂
46、布平板法分别接入0.1 m L 稀释液，经适当培养后，3 个平板上的菌落数分别为5 6、5 7 和 5 8。下列叙述错误的是（）A.可得出土壤样液中活菌数大约为5.7 X 1 07个/LB.此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低C.一般选择菌落数在3 0 3 0 0 的平板进行计数D.显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数答 案 D解析 根据分析可知，每升样品中的活菌数为（5 6 +5 8 +5 7）+3 +0.1 X 1 O O O X 1 O O =5.7 X1 0“个），A项正确；由于两个或多个细菌形成一个菌落，所以此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B项正确；显微镜直接计数法
47、统计的是稀释液中所有个体的数目，包括死菌，D项错误。9.某生物兴趣小组完成了“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”的实验，具体操作流程如图所示。下列相关叙述不正确的是（）().5 mL().5 mL0.5 mL10 g土样90 mL 土壤悬无 菌 水 浮 液无菌水纯化培养A.在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中B.梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作C.振荡的目的是为了增加尿素分解菌的浓度D.由图示菌落计数结果可知1 0 克土样中的菌株数约为1.6 X 1 0,个答 案 C解析酒精灯火焰附近存在一个无菌区，在酒精灯火焰附近称取土壤并将其倒入锥形瓶中，可以防止称取的土壤在倒入锥形瓶过程中
48、，土样被污染，A项正确；只用移液管，分度太低,而只用微量移液器，容量又太小，所以梯度稀释时可用移液管或微量移液器进行操作，B项正确；振荡培养的目的是提高培养液的溶解氧的含量，使菌体充分接触培养液，提高营养物质的利用率，C项错误；由分析可知，每克土壤中的菌株数为1.6 X 即 1 0 克土样中的菌株数约为1.6 X 1 0,个，D项正确。1 0.下图为实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作步骤，下列说法不正确的是（）A.步骤使用的培养基是已经灭菌的培养基B.步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行C.到的过程中，接种环共灼烧了 5次D.步骤操作时，不能将第1区和第5区的划线相连答 案C解析 接种环在每次
49、划线前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以到的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，到的过程中共需灼烧接种环6次，C项错误。11.如图所示，自来水经滤膜过滤后，转移到牛肉膏蛋白陈培养基上，适宜条件下培养48h,染色后统计变色菌落数目为165个。下列说法正确的是（）A.若培养基含伊红一亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈蓝绿色B.自来水中大肠杆菌浓度是33个比真实值偏大C.为了提高准确度，需设重复实验，但不用空白对照D.若培养基菌落数目大于3 0 0,可适当减少自来水量答 案D解析若培养基含伊红一亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈深紫色，有金属光泽，A项错误；自来水中大肠杆
50、菌浓度是165+5=33（个/L）,由于两个或多个大肠杆菌可能长成一个菌落，因此比真实值偏小，B项错误；为了提高准确度，需设重复实验，同时需要设置空白对照，C项错误:若培养基菌落数目大于3 0 0,说明细菌数目较多，可适当减少自来水量，D项正确。二、非选择题12.（2022 广东六校联盟高三联考）为了检测牛奶中是否含有某种微生物，配制的培养基的配方如下，请分析回答下列问题（注：伊红一亚甲蓝是由两种染色剂组成的细胞染料）：蛋白陈乳糖蔗糖K2H P O 1伊红亚甲蓝蒸储水1 0 g5 g5 g2 g0.4 g0.0 6 5 g1 0 0 0 m L将培养基p H 调至7.2根据配方，该培养基可用来