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1、 ICS 65.020.01 CCS B 05 3301 浙江省杭州市地方标准 DB3301/T 11202023 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR 标记法 2023-02-28 发布 2023-03-28 实施 杭州市市场监督管理局 发 布 DB3301/T 11202023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 仪器设备及试剂.1 6 溶液配制.3 7 操作程序.3 8 判定方法.4 附录 A（规范性）溶液配制.6 附录 B（资料性）推荐引物.8 DB3301/T 11202023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020
2、标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由杭州市农业农村局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：杭州市农业科学研究院、杭州市农业农村事务保障中心。本文件主要起草人：严建立、黄雨晴、阮松林、钱丽华、应武、陆秋君、蔡和平。DB3301/T 11202023 1 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR 标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats,SSR）标记进行三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）不同种
3、质资源鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序及判定方法。本文件适用于三叶青种质资源SSR指纹数据采集及种质资源鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。引物 primer 在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的一小段单链脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ri
4、bonucleic Acid，RNA）。参照种质资源 reference germplasm resource 具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照种质资源用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。注：本文件选用的参照品种为：三叶青2012-1。4 原理 由于不同三叶青种质资源遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列（SSR）的重复次数有差异，从而使得不同种质资源中的简单重复序列长度存在差异。这种差异可以通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同种质资源。5 仪器设备及试剂 一般规定 DB330
5、1/T 11202023 2 本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 66822008中规定的三级水。仪器设备 本方法中所用的仪器设备包括：a)普通电泳仪；b)垂直电泳槽及配套的制胶附件；c)水浴锅；d)水平摇床；e)高速冷冻离心机（最大离心力不小于 20 000 g）；f)电子天平（精度为千分之一）；g)微量移液器（量程分别为 10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L、5 000 L）；h)pH 计；i)冰箱（4 和-20）；j)磁力搅拌器；k)核酸定量测定仪；l)微波炉；m)高压蒸汽灭菌锅；n)制冰机；o)组织破碎仪；p)凝胶成像系统；q)超
6、纯水仪。所用试剂 本方法中所用的试剂包括：a)十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）；b)三氯甲烷；c)异戊醇；d)异丙醇；e)乙醇；f)乙二胺四乙酸二钠；g)三羟甲基氨基甲烷；h)SSR 引物；i)DNA 标准分子量标记（marker）；j)5 PCR 预混液 Pre-Mix（含 Mg2+、Taq 酶、dNTP 和染料指示剂）；k)琼脂糖；l)冰醋酸；m)氢氧化钠；n)丙烯酰胺；o)甲叉双丙烯酰胺；p)过硫酸铵；q)四甲基乙二胺；r)硝酸银；DB3301/T 11202023 3 s)甲醛；t)乙二胺四乙酸；u)硼酸；v)氯化钠。6 溶
7、液配制 按照附录A的规定配制溶液。7 操作程序 样品准备 选取三叶青幼嫩叶片，每份样品检测5张叶片的混合样，并设置三个重复。DNA 提取 DNA提取应按照以下步骤进行：a)将 0.5 g 叶片剪碎后放入 2.0 mL 离心管，加入 800 L 经 65 预热的十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide,CTAB）缓冲提取液，加入 2 粒钢珠，置于组织破碎仪上研磨充分成匀浆；b)上述匀浆经 65 水浴 1 h，期间颠倒混匀 2 次3 次，取出静置 2 min，而后在离心机中 10 000 g 离心 15 min，用移液器小心吸取 500 L 左右上清液至另
8、一个洁净离心管中，加入 500 L 的三氯甲烷:异戊醇（体积比为 24:1）溶液，颠倒混匀，置于离心机中 10 000 g 离心 10 min；c)小心吸取上述所得上清液约 450 L，加入异丙醇 300 L，颠倒混匀，在-20 冰箱中放置 20 min，置于离心机中 10 000 g 离心 15 min；d)倒掉上述上清液，依次加 500 L 75%和 100%乙醇各洗一次，晾干后，加入 100 L 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA buffer solution，TE）水溶液溶解，经核酸定量测定仪测定 DNA 浓度，用超纯水将 DNA 稀释至约 100 ng/L，以备后续
9、 PCR 扩增，-20保存。PCR 扩增 7.3.1 引物选择 宜选择附录B中引物进行扩增。7.3.2 反应体系 SSR-PCR扩增体系为15 L，包括3 L Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示剂）、1 L模板（含75 ng100 ng上述提取所得DNA）、0.6 L正向引物（0.4 mol/L）、0.6 L反向引物（0.4 mol/L）和超纯水9.8 L。7.3.3 PCR 反应程序 PCR反应程序如下：a)94 预变性 5 min；b)94 变性 1 min；DB3301/T 11202023 4 c)60 退火 45 s；d)72 延伸 30 s60 s；e)重复
10、b）d），共 35 个循环；f)72 延伸 5 min；g)4 保存。PCR 产物检测 7.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.4.1.1 凝胶准备 凝胶制备应按照如下步骤进行：a)将垂直夹心式电泳装置的玻璃板与胶皮套装在一起，取微波炉煮沸后的 1%琼脂糖封胶液约 5 mL 封住玻璃板底部的缝隙，制成铸胶槽；b)在烧杯中依次加入 5 mL 5 Tris-硼酸（TBE）缓冲液，5 mL 40%丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液，超纯水 14.8 mL，摇匀后加入 200 L 10%过硫酸铵和 12 L 四甲基二乙胺（TEMED），搅拌混匀后注满铸胶槽，随即插好样孔梳，于室温下静置直至凝胶完全聚合后
11、使用。7.4.1.2 电泳 去掉封口的琼脂糖胶，将胶板固定于垂直电泳槽中，在电泳槽中加满1 TBE缓冲液，小心抽出样孔梳，用移液器吸取TBE缓冲液冲洗每个点样孔2次，然后向加样孔中点入1.5 L PCR反应产物；同时，在一侧加样孔中加入DNA标准分子量标记（marker）。按样品向正极迁移接通电源，以5 V/cm（正负极间距离）恒压电泳约2.5 h。7.4.2 银染显色 电泳完毕后关闭电源，取下玻璃板。小心分开两块玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶30 s60 s，放入染色液中，轻摇5 min10 min进行染色；然后将凝胶从染色液中取出，用蒸馏水快速漂洗2次，每次30 s60 s，
12、放入显影液中，轻摇至显色出清晰带纹，取出凝胶用蒸馏水冲洗2遍，沥干后扫描或拍摄成像。数据处理 应根据扩增产物的电泳图谱，在相同迁移位置处，有电泳条带记为“1”，无条带记为“0”，生成矩阵。以此来实现电泳带型的数据化，并鉴定参试材料。示例：标记 SSR-X 在所有材料中共扩增出 4 条大小不同的条带，按照从小到大依次编号为 SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-X-3、SSR-X-4，用标记 SSR-Y 分析在所有材料中共扩增出 3 条大小不同的条带，依次编为 SSR-Y-1、SSR-Y-2、SSR-Y-3。若材料 1 显示的条带为 SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-Y-1、SSR-Y-
13、3，则其带型数据为 1100101，若材料 2 显示的条带为 SSR-X-1、SSR-X-3、SSR-Y-1、SSR-Y-3，则其带型数据为 1010101，同样可给出其它参试材料的带型数据。由此，可建立每份材料的数字化指纹，每一数字对应一个扩增条带或位点。8 判定方法 按照由带型数据赋予的数字化指纹，可单独或联合使用的标记鉴定材料材料的异同，具体如下：a)当样品间差异位点数2，判定为“不同”；b)当样品间差异位点数=1，判定为“高度相似”；DB3301/T 11202023 5 c)当样品间差异位点数=0，判定为极近似或相同。DB3301/T 11202023 6 A A 附录A （规范性）
14、溶液配制 A.1 DNA 提取溶液的配制 A.1.1 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液 称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）20.0 g、氯化钠（NaCl）81.816 g、乙二胺四乙酸（EDTA）2.922 g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.114 g于1 000 mL烧杯中，加入800 mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。A.1.2 TE水溶液 称取乙二胺四乙酸（EDTA）0.292 g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.211 g于1 000 mL烧杯中，加入800
15、 mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。A.1.3 三氯甲烷-异戊醇（24:1）按体积比24:1的比例配制混合液。A.1.4 75%乙醇溶液 取750 mL无水乙醇于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL。A.2 PCR 扩增所需 SSR 引物的配制 用超纯水配制浓度为10 mol/L的SSR引物工作液。A.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 A.3.1 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液 称取186.1 g乙二胺四乙酸二钠盐于1 000 mL烧杯
16、中，加入800 mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL。A.3.2 5TBE缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）54.0 g和硼酸27.5 g于1 000 mL烧杯中，加入20 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液，加入800 mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL。A.3.3 1TBE 缓冲液 量取5 TBE缓冲液200 mL于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL。A.3.4 40%丙烯酰胺溶液 分别称取丙烯酰胺190.0 g和甲叉
17、双丙烯酰胺10.0 g于500 mL烧杯中，加入300 mL超纯水溶解，后转移至容量瓶中定容至500 mL，避光保存。DB3301/T 11202023 7 A.3.5 10%过硫酸铵溶液 称取10.0 g过硫酸铵，溶于100 mL水中。A.4 银染溶液的配制 A.4.1 固定液 量取100 mL冰醋酸于1 000 mL容量瓶中，加超纯水定容至1 000 mL。A.4.2 染色液 称取1.0 g硝酸银于1 000 mL烧杯中，加800 mL超纯水溶解，转移至1 000 mL容量瓶中，定容至1 000 mL，避光保存。A.4.3 显影液 称取10.0 g氢氧化钠于1 000 mL烧杯中，加入80
18、0 mL超纯水溶解，量取5 mL甲醛，转移至1 000 mL容量瓶中定容至1 000 mL。DB3301/T 11202023 8 B B 附录B （资料性）推荐引物 引物系根据三叶青参照种质资源 2012-1 转录组测序数据开发，并用设计的 60 对引物对 45 份三叶青材料进行过测试，组合运用一些引物可将参试材料完全区分。为此，选择其中 12 对扩增条带清晰、多态性信息含量高（多态性信息含量大于 0.53）的引物作为三叶青种质资源鉴定的推荐引物。在实际资源鉴定中，这些推荐引物不一定都用，可按表 B.1 中引物排列顺序选用或组合使用，推荐引物见表 B.1。表B.1 推荐引物 基因 ID SS
19、R 编号 引物序列 F/R(5-3)预期产物（bp）c68169 THSSR47 GCCCATCAAAGCTCTCTCAC 167 AGGCATCAACTCCTTAGCGA c66945 THSSR6 CCAAGATAATCTGGCCTCCA 279 TTTGATTCCTTTTGGGTTGG c70882 THSSR59 AAGAGGGAGCCTGGAATCAT 278 AGCTGAATGTGAGGACGGAC c66457 THSSR5 GGAGGTGGAGGTACTGGTGA 217 TCCAATTCCATCCCTTTGAG c60999 THSSR31 TGGGTCTCTATCGTTTT
20、CTGC 278 TCAAACCCTTCCATGCTTCT c64355 THSSR39 CCGAACCCCAACTGTAGAAA 187 CACAGTTTCTGTGAAGCGGA c57644 THSSR8 GCCACACACAAACACACACA 248 GCTGGAAGCAAATTCAAAGC c62119 THSSR45 CAGCACTAAGCTCACCACGA 233 CAAACTGATCCCCTTTTGGA c69821 THSSR10 ATGTGGCCCAATTTTGTCAT 163 CCCAAATAAACCTCCCTGGT c56402 THSSR3 AAAAACGAAAAGCTCGCTCC 183 GCGGTGTTATGGAAGGAGAA c54644 THSSR41 CAAGTAGAACGAAGCGAGGG 274 TCTCCATTCCCATTTCAACC c69725 THSSR9 ACATGAGGTGGGTGGAGAAG 191 GGCAGTTCTGGATTTCTGGA