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1、ICS 65.020.20B 1 6省 地陕 西DB61方 标 准DB 61/T 1 3692020狒猴桃细菌性溃疡病早期监测技术规范Guidel ine f or earl y surveil l ance of Pseudomonas syringae pv.actinidiae of Kiwif ruit2020-09-1 5 发布2020-10-15 实施陕西省市场监督管理局发布DB61/T 1 3692020目 次前言.II1 范围.12规范性引用文件.13符号代号和缩略语.14原理.15监测时期.16检测方法.17结果判定.28检测样品与菌株保存.29结果记录与资料保存.3附录A(
2、规范性附录)物猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)相关资料.4附录B(规范性附录)猿猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)的菌落PCR检测方法.7附录C(规范性附录)猿猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)LAMP检测方法.9IDB61/T 1 3692020 刖 B本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由西北农林科技大学提出。本标准由陕西省农业农村厅归口。本标准起草单位：西北农林科技大学，陕西省植物保护工作总站。本标准主要起草人：黄丽丽、徐亮胜、王娜娜、高小宁、冯浩、范东晟。本标准由西北农林科技大学负责解释。本标准首次发布。联系信息如下：单位：西北农林科技大学电话：02987091312地址：陕西省杨
3、凌区邰成路西北农林科技大学邮编：712100IIDB61/T 1 3692020舜猴桃细菌性溃疡病早期监测技术规范1范围本标准规定了舜猴桃细菌性溃疡病监测技术的原理、监测时期、检测方法、结果判定、检测样品与 菌株保存、结果记录与资料保存的要求和内容。本标准适用于以常规生物学鉴定方法、环介导等温扩增技术（l oop-mediated isoth ermal ampl if ication,LAMP）和菌落PCR检测方法两种分子检测技术为基础，对掰猴桃细菌性溃疡病进行早期监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用
4、文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008分析实验室用水规格和试验方法。GB/T 236212009农业植物检疫实验室基础条件3符号代号和缩略语下列缩略语适用于本文件。英文缩略语中文翻译英文全称LAMP环介导恒温扩增Loop-mediated isoth ermal ampl if icationBetaine甜菜碱/Bst酶BstDNA聚合酶（大片段）Bst DNA pol ymerase(l arge f ragment)dNTP脱氧核糖昔三磷酸deoxyribonucl eoside triph osph ate4原理猗猴桃溃疡病菌可侵染叶片、枝条、花朵
5、和果实等组织，并在其中存活和繁殖扩展。带菌植株早期 从外观上和健康植株无明显差异，难以识别。本标准利用常规生物学鉴定方法、菌落PCR检测方法和环 介导等温扩增技术进行检测，为早期监测和预防獗猴桃细菌性溃疡病提供技术支撑。5监测时期苗木定植、接穗采集、嫁接、田间授粉、修剪等农事活动前后分别进行1次检测监测。6检测方法6.1 实验室要求猿猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T 236212009要求。1DB61/T 1 36920206.2 采样按照五点式取样法或1%繁殖材料样本量取样，采集待检测獗猴桃叶片、枝条、花朵或果实。6.3 待检材料保存样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内
6、防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。6.4 方法6.4.1检测方法包括分离物菌落形态和基因组特异序列PCR扩增，LAMP检测技术等方法的观察结果进行鉴定。6.4.2常规生物学观察采用常规组织分离法，将采集的样品，用无菌的手术刀切取部分组织，用70%酒精或0.6%的次 氯酸钠（NaCl O）表面消毒处理3 min5 min,再用无菌水冲洗3次。将病变组织悬浮于少量无菌水中，用无菌玻璃棒挤压，使组织中的细菌流入水中形成悬浮液。轻轻混匀后用接种环蘸取悬浮液，在选择性 培养基（KBA+蔡咤酮酸（终浓度为l Ong/mL）上划线分离，封皿后25 恒温培养2 d3 d,筛选疑 似菌落进行划线纯化
7、，观察菌落形态和病原菌形态特征。猿猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征见 附录A第A.6章，根据菌落特征选取可疑菌落做进一步PCR鉴定。6.4.3菌落PCR检测方法用已知的舜猴桃溃疡病菌标准菌株（M228）作为阳性对照，丁香假单胞杆菌番茄致病变种或等效 标准菌株作为阴性对照，灭菌双蒸水作为空白对照进行PCR检测，PCR检测方法和操作流程见附录B。6.4.4 LAMP检测技术操作流程详见附录C。7结果判定7.1 常规实验结果判定通过常规实验观察，分离培养放置6 d以上。如发现疑似细菌菌落，做进一步PCR鉴定。若PCR检测 结果为阳性，且扩增产物片断大小与描述相符（即扩增产物大小为310bp）,可
8、以判定为待测样品中携 带有舜猴桃细菌性溃疡病；否则为阴性。7.2 LAMP结果判定通过LAMP检测的，若检测结果为阳性（即待检样品反应管液体呈绿色），可以判定为检出襁猴桃 溃疡病菌，否则为阴性。8检测样品与菌株保存备份样品及从样品中分离到并鉴定为舜猴桃溃疡病菌的菌株，应妥善保存。备份样品可置于4 冰 箱保存，菌株可接种于KBA培养基斜面上，25 恒温培养2 d3 d后置于4 C冰箱保存，或加入10%体 积的甘油制成甘油菌液，置于-80 冰箱长期保存。2DB61/T 1 36920209结果记录与资料保存检测记录应包括：样品来源、种类（品种）、时间、检测的时间、地点、方法和结果等，并要有检 测人
9、员、审核人员签字。生物学检测需要有寄主的症状照片，PCR检测需要有电泳结果照片，LAMP检 测结果需要有样品反应管显色照片等，上述材料应归档并妥善保存。3DB61/T 1 3692020附录A(规范性附录)招猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)相关资料A.1英文名称Kiwif ruit Bacterial CankerA.2学名Pseudomonas syringae pv.actinidiaeA.3分布地区中国、日本、韩国、新西兰、意大利、美国、法国、葡萄牙、土尔其、西班牙、伊朗、希腊。A.4寄主范围该病原菌自然侵染的寄主主要为猿猴桃属成a Lindl)；人工接种可侵染桃(Prunuspersica
10、)、樱桃(尸avium),李(.Prunus salicina)、烟草(Nicotiana tabacum)番茄(Lycopersicon esculentum)A.5病害症状A.5.1枝溃疡症状多从茎蔓幼芽、皮孔、叶痕、果柄痕及枝条分叉部位开始发病，初期呈水渍状，后扩大，颜色加深,皮层组织变软隆起，与木质部分离，后期病部皮层纵向线状龟裂，伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出 白色黏液，伤流期与植株伤流液混合后变为红褐色或铁锈红色，剥开皮层后可见木质部呈黑褐色，韧皮 部溃疡腐烂，病斑绕茎扩展到新梢后影响营养和水分的吸收与输送导致新梢枝叶萎焉枯死(见图A.1)o图A.1枝溃疡症状4DB61/T 1
11、3692020A.5.2叶斑症状新生叶片上呈现红色小点，后形成2mm3mm不规则褐色或暗褐色病斑，病斑周围有2mm5 mm 的明显水渍状黄色晕圈，潮湿条件下病斑扩大，导致整个叶片焦枯、卷曲(见图A.2)。图A.2叶斑症状A.5.3花腐症状花蕾受害后严重的不能张开，变褐死后脱落；受害较轻的花蕾虽能开放，但开放速度慢或不能完全 开放，这种花可能脱落也可能座果，通常果实较小，易落果或发育成畸形果(见图A.3)。图A.3花腐症状A.6病原菌形态特征及培养性状A.6.1舜猴桃溃疡病菌为好氧细菌，病原菌菌体直杆状，有的稍弯曲，单细胞，菌体大小为(1.42.3)Fimx(0.4-0.5)pm,多数具1根极生
12、鞭毛，少数为2根3根。革兰氏染色阴性，不具荚膜，不 产生芽泡。A.6.2在KBA培养基上菌落呈白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光；在牛肉蛋白腺培养基上呈圆 形、乳白色、表面光滑、全缘。5DB61/T 1 3692020A.6.3病原菌生长最适温度为25-28,生长最高温度为35,生长最低温度为-1 2 C以下，致 死温度为55、10 min。A.7传播途径该病原菌的远距离传播主要靠带菌苗木、接穗、花粉和昆虫。在田间，该病原菌主要通过雨水、灌 溉水、农具、昆虫等传播，由伤口、自然孔口等侵入寄主组织。6DB61/T 1 3692020附录B(规范性附录)猫猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)的菌落PCR
13、检测方法B.1试剂及配制B.1.1 TE缓冲液：10 mM Tris HCl,1 mM EDTA,pH8.0=B.1.2 PCR试剂：特异引物对(1 0 pmol/L)、2xTaq Master Mix、2000 bp DNA Marker、5 mol/L N aCl、无水乙醇、70%乙醇、核酸染料。B.1.3电泳缓冲液TBE(5x)(pH 8.0)：每升溶液中含54 g Tris,27.5 g硼酸，10 mM EDTA=电泳 时稀释成卜浓度使用。B.1.4琼脂糖凝胶(1%)：称取0.1 g琼脂糖加入到10 mL l xTBE溶液中，微波炉煮沸后加入1%。体 积核酸染料，混匀后制胶。B.2 P
14、CR检测B.2.1 PCR检测引物引物对 1：Psa-F/Psa-R(引物序歹！J为正向引物Psa-Fl:5-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3、反向 引物Psa-Rl:5-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3,扩增片段长度为310 bp)=B.2.2 PCR反应体系及扩增条件B.2.2.1 PCR反应体系：正反引物各0.5 pL、2xTaq Master Mix 5 pL、补灭菌超纯水至反应体系总 体积为10 flL=B.2.2.2先用PCR管配置好菌落PCR反应溶液，放于超净台中，将划线培养好的KBA平板，于无菌超 净台中打开，用灭过菌的白色枪头挑取部分单菌落，放于PC
15、R管中，用移液枪吹打，使挑取的细菌与反 应液混匀，即可获取细菌DNA模板。B.2.2.3 PCR扩增条件：94 预变性 10 min；94 变性30 s,60 退火35 s,72 延伸90 s,36 c ycl es；72 5 min,4 保存。B.2.2.4在进行PCR检测时，必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。B.3凝胶电泳取出PCR样品，吸取8匹PCR产物加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中，同时用2000 bp DNA Marker作 为片段大小的标准，置于l xTBE电泳缓冲液中电泳30 min40 min。B.4成像观察与记录电泳结束后，取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下，根据DNA Mar
16、ker片段判断扩增出的目的条带的 大小，记录观察结果，并将电子文件存档备查。7DB61/T 1 3692020B.5结果判定B.5.1.1如果待测样品和阳性对照同时出现相同大小的特异性条带，而阴性对照、空白对照均没有该 特异条带，则判定待测样品为阳性；B.5.1.2如果阳性对照出现目的条带，而阴性对照、空白对照、待测样品中均未出现目的条带，则判 定待测样品为阴性；B.5.1.3检测结果如图B.1。M 1 22000310说明1一一阳性结果;2阴性结果。图B.1检测结果8DB61/T 1 3692020附录C(规范性附录)猫猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)LAMP检测方法C.1试剂仪器和耗材C.1.
17、1试剂C.1.1.1引物：选取保守的特异性序列，设计出能专一性鉴别毅猴桃细菌性溃疡病的特异性引物组,引物序列见表C.1。表C J LAMP检测技术引物序列引物类型引物序列上游外引物(F3)5,-GCTATGGAATCCATTGCGGT-3,下游外引物(B3)5,-CGCATCTGCTGGATCArCC-3,上游内引物(FIP)5,-ATCCCTTGCCCAGCACGAACATGAGGTCGAGGTGTCTGA-3,下游内引物(BIP)5,-ATCCACAGTGGGTACACGGACGGGGGCACCTTCTTTCTTGG-3,上游环引物(LoopF)5,-GGCCTTTTCAATGCGGTCA
18、ATArCC-3,下游环引物(LoopR)5,-GGTGTCAATCTGGTGGTGCAT-3,C.1.1.2 Bst DNA pol ymerase:8 U/jiL,不要反复冻融或温度剧烈变化。C.1.1.3 5义 reaction mixture：含 100 mM的Tris-HCL、250 mM的氯化钾溶液、50 mM的硫酸锈溶液、40 mM 硫酸镁溶液、0.1%的丁加20、25 M 的betaine(甜菜碱)、3 mM 的dNTPs。C.1.1.4 显色液：l OOOxSYBR Green 1=C.1.1.5阳性对照：Psa参考菌株。C.1.2仪器与耗材C.1.2.1水浴锅或加热模块：6
19、5+1 oC.1.2.2 移液器：量程0.5 nL-1 0 pL,量程 10 pL-1 00 gL,量程 100 pL-1 000 匹。C.1.2.3 0.2 mL和1.5 mL塑料离心管。C.1.2.4吸头，配套移液器待用。C.1.2.5计时器。注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 66822008规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的 容器分装。9DB61/T 1 3692020C.2操作步骤C.2.1样品处理样品通过清水冲洗和70%的酒精表面消毒后，利用灭菌手术刀切下约为0.2 g的植物组织，切碎并 悬浮于2 mL无菌水中，30 min后用移液枪收集悬浮液于1.5 m
20、l离心管中，加热煮沸20 min后，可直接用 做下一步LAMP检测技术反应体系的模板。C.2.2 Psa的LAMP检测C.2.2.1 LAMP反应体系尸相的LAMP反应体系见表C.2。表C.2 Psa LAMP反应体系（25匹）组分工作液浓度加样量/hL5xreaction mixture5x5上游外引物10 gmol/L0.2下游外引物10 gmol/L0.2上游内引物10 gmol/L1.2下游内引物10 gmol/L1.2上游环引物1 0 gmol/L0.6下游环引物1 0 gmol/L0.6Bst DNA pol ymerase8U/pL1ddH2O/1 4模板/1C.2.2.2 LA
21、MP反应过程按照表C.2所述配制反应体系：65 恒温扩增60 min,80 使酶失活10 min,反应即结束。C.2.2.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置C.2.2.3.1每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。C.2.2.3.2空白对照以ddH2。代替模板。C.2.2.3.3阴性对照以不含尸sa样品的悬浮液为模板。C.3结果观察在上述反应管中加入1 pL荧光染料SYBRGreenL轻轻混匀并观察颜色变化。C.4结果判定在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：a）阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品检测结果为阳性。b）阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，该样品检测结果为阴性。详见图C.1。10DB61/T 1 3692020+图C.1结果判定对照11