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1、 ICS 67.080.01 CCS X10 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25542022 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 BDB15/T 25542022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、武晶晶、宋利文、云伏雨、张春华、羿静、康长清。DB15/T 25542022 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 1 范围
2、 本文件规定了发酵番茄渣中益生性乳酸菌分离与鉴定的规范性引用文件、术语与定义、材料及操作规程等技术要求与规范。本文件适用于发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 3 术语和定义 3.13.23.33.4DB15/T 25542022 番茄渣来源 来自工厂的新鲜番茄渣。发酵番茄渣的制备与保存 每个聚乙烯塑料袋中称取100 g番茄
3、渣，用真空包装机抽成真空并封口。每个处理设3个重复，于户外进行为期30 d、60 d和90 d的厌氧发酵，在第30 d、60 d和90 d分别取样，将样品装在无菌袋中，放入冰盒带回实验室尽快进行乳酸菌的分离。5 操作规程 菌株和细胞 5.1.1 菌株 指示菌：致病性的大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。试验菌：从发酵番茄渣中分离出的乳酸菌。5.1.2 细胞 Caco-2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。仪器设备4.14.25.15.2
4、5.35.4DB15/T 25542022 称取10.0 g发酵番茄渣加入放有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，置于恒温摇床中震荡30 min制备菌悬液并进行十倍梯度稀释，稀释液涂布于MRS平板上，37 厌氧条件下培养48 h。根据菌落的大小、颜色、形状及边缘特征将不同的菌在MRS平板上进行分离。5.4.2 纯化与保藏 将已经分离的菌株在 MRS平板上反复划线纯化。将纯化的单菌落接种于MRS肉汤中，37 厌氧条件下培养24 h，将菌液与60%的无菌甘油以7：3的比例混匀，密封后放置在涡旋震荡仪上震荡混匀，-80 保存。乳酸菌鉴定 5.5.1 形态学鉴定 按GB 4789.35的规定操作。5.5
5、.2 分子学鉴定 5.5.2.1 DNA 提取 取出-80 冻存的乳酸菌菌株，室温融化后用接种环挑取适量菌液，采用三区划线法在MRS平板上划线进行活化。用接种环挑取单菌落到MRS肉汤中进行扩大培养，37 厌氧培养18 h用于DNA的提取，方法参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。5.5.2.2 扩增 5.5DB15/T 25542022 4 度稀释涂板计数计算存活率，每种菌3个重复。存活率=3 h的菌落数/0 h的菌落数100%，存活率大于10%即认定为可以耐受胃酸的环境。5.6.2 胆盐耐受性测定 将冻存乳酸菌活化后挑单菌落接种于MRS肉汤中。将菌液按5%的接种量接种于含0.0%、0.3%、
6、0.5%和1.0%胆盐的MRS-THIO培养基中。37 厌氧培养24 h，分别测定不同胆盐浓度培养基的OD值来计算菌株对胆盐的耐受性。胆盐的耐受性=含有不同浓度胆盐的培养基的OD值/不含胆盐培养基的OD值100%，存活率大于10%即认定为具有胆盐耐受性。5.6.3 乳酸菌对 Caco-2 细胞粘附能力的测定 5.6.3.1 Caco-2 细胞培养 5.6.3.1.1 复苏培养 从液氮中取出Caco-2细胞冻存管，立即放入40 的水浴中摇晃融化。将细胞悬液吸入装有8 mL培养液的离心管中，300 g离心8 min，弃上清后加入12 mL的新鲜培养液，用移液枪吹打均匀后加到培养瓶中，于37、5%C
7、O2培养箱中培养。5.6.3.1.2 传代消化 待细胞长到80%90%的时候进行传代。吸掉旧的培养液，用加了双抗的PBS洗两次，然后加入1 mL2 mL的胰酶，于37 放置2 min。显微镜观察，大部分细胞变为圆形后加血清终止消化，反复吹打直到细胞完全脱落。300 g离心8 min，弃上清后将细胞分装到培养瓶中培养。培养好后消化制成细胞悬液，加到放有盖玻片的6孔板中(2 mL/well)，待细胞贴壁后，吸掉旧的培养液，用不加双抗的PBS洗2次后用于粘附实验。5.6.3.2 粘附能力的测定 将冻存的乳酸菌活化，挑取单菌落接入 MRS 肉汤中厌氧培养 24 h。1000 g 离心 10 min，用
8、无菌的PBS 洗 3 次后，用 MEM 培养液悬浮至 1.0108 CFU/mL，用于后续的粘附实验。分别取1 mL的菌液加入5.6.3.1.2所述6孔板中37 培养3 h后终止，用无菌PBS洗5次，洗掉未粘附的乳酸菌，室温晾干后加甲醇固定30 min，将盖玻片进行革兰氏染色，油镜下观察。每张盖玻片随机计数50个细胞上粘附的乳酸菌数量，每组3个平行。每个细胞上粘附3个以上乳酸菌即认定为具有粘附能力。5.6.4 抑菌能力的检测 5.6.4.1 菌株活化培养 5.6.4.1.1 乳酸菌活化培养 将冻存乳酸菌活化后挑取单菌落接种于MRS肉汤中。37 厌氧培养24 h后，1000 g离心10 min后
9、取上清。5.6.4.1.2 致病菌活化培养 将冻存于-80 的Escherichia coli和Staphylococcus aureus分别在固体LB培养基和脑心浸出液培养基上划线。37 过夜后，挑取单菌落分别接种于相应的液体培养基中，37 培养24 h后备用。5.6.4.2 抑菌能力检测 DB15/T 25542022 5 分别取100 L Escherichia coli和Staphylococcus aureus菌液涂布于固体LB培养基和脑心浸出液培养基上，然后将牛津杯放于平板中央，每种乳酸菌做3个平行实验。在牛津杯的中央加100 L乳酸菌液，37 培养24 h后测定每种菌抑菌圈的直径
10、（mm），结果用平均差标准差表示。对大肠杆菌的抑菌圈直径大于等于5.400.20即可认定为具有抑菌能力，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于等于15.500.10即可认定为具有抑菌能力。DB15/T 25542022 6 A A 附录A （规范性）溶液配制 表A.1规定了溶液配制方法。表A.1 溶液配制 溶液名称 成分 制备 人工胃液 氯化钠 2 g 胃蛋白酶 3.5 g 超纯水 1000 mL 1N 盐酸调 pH 至 3.0，过滤除菌，4 保存。MRS-THIO 培养基 100mL MRS 培养基 0.2 g 巯基乙酸钠 121 高压灭菌 15 min。LB 培养基 酵母提取物 5 g 胰蛋白胨 10 g 氯化钠 10 g 超纯水 1000 mL 氢氧化钠调 pH 至 7.07.4，121 高压灭菌 15 min。Caco-2 细胞培养液 MEM 培养液 156 mL 丙酮酸钠 2 mL 青链霉素双抗 2 mL 碳酸氢钠 0.3 g 胎牛血清 40 mL 过滤除菌，4 保存。