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1、第第1 1章章 发酵工程发酵工程第第2 2节节 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用本节聚焦本节聚焦怎样运用怎样运用生物与环境相适应生物与环境相适应的观点来理解的观点来理解选择培养选择培养的原理？的原理？如何通过调整培养基的配方来如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物有目的地培养某种微生物？测定微生物数量测定微生物数量的常用方法有哪些？的常用方法有哪些？二、微生物的选择培养和计数二、微生物的选择培养和计数稀释涂布平板法稀释涂布平板法呈现的杂菌群呈现的杂菌群 1973年，科学家从美国黄石国家公园的年，科学家从美国黄石国家公园的热泉热泉中筛选出中筛选出水水生栖生栖热菌热菌，进而从
2、这种菌中，进而从这种菌中提取出耐高温的提取出耐高温的DNA聚合酶聚合酶。聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）是）是一种在体外一种在体外扩增扩增DNA片段的技术片段的技术，此项技术要求，此项技术要求使用使用耐高温耐高温的的DNA聚合酶聚合酶。寻找耐高温的DNA聚合酶为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？水生栖热菌能在水生栖热菌能在70-80高温条件下高温条件下生存生存，而，而绝大多数微生物在此绝大多数微生物在此条件下不能生存条件下不能生存。根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原则：耐寒微生物石油分解菌被石油污染的土壤被石油污染的土壤
3、冰川冻土层冰川冻土层实验室筛选微生物原理：实验室筛选微生物原理：人为提供人为提供_的条件（包括的条件（包括_、_和和_等），同时等），同时_有利于目的菌生长有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长抑制或阻止其他微生物的生长营养营养温度温度pHpH允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。一、选择培养基1.概念：2.方法：分离得到酵母菌、霉菌等分离固氮菌分离自养型微生物不加含碳有机物的培养基不加氮源的培养基加入青霉素的培养基（1）在培养基中加入某种化学物质。分离得到金黄色葡萄球菌加入高浓度食盐的培养基（2）改变培养基中的营养成分。（3）改变微生物的培养条件。耐高温微生
4、物高温环境下培养厌氧型微生物兼性厌氧型无氧环境下培养 尿素CO(NH2)2含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：讨论：1.1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？来，培养基的配方该如何设计？2.2.该培养基与该培养基与普通培养基普通培养基有哪些共同点和不同点？有哪
5、些共同点和不同点？设计一种选择培养基设计一种选择培养基,尿素作为唯一氮源。尿素作为唯一氮源。区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。(细菌生长的氮源)尿素 NH3 脲酶脲酶尿素分解菌尿素分解菌思考讨论选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计进一步思考：进一步思考：怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。思考讨论1.1.提出问题提出问题土壤中
6、含有能分解尿素的细菌，我们如何土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离分离它们？它们？利用以利用以“尿素作为唯一氮源尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。的选择培养基，可以分离。2.2.做出假设做出假设3.3.实验设计实验设计实验步骤实验步骤 探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数实验原理实验原理绝绝大大多多数数微微生生物物都都能能利利用用葡葡萄萄糖糖，但但是是只只有有能能合合成成_的的微微生生物物才才能能分分解解尿尿素素，利利用用以以_作作为为唯唯一一氮氮源源的的_，可以从土壤中分离出可以从土壤中分离出分解尿素分解尿
7、素的的细菌细菌。CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶2 2NHNH3 3+CO+CO2 2每克土壤样品究竟含有每克土壤样品究竟含有多少多少这样的细菌？这样的细菌？脲酶脲酶尿素尿素选择培养基选择培养基操作示范视频：培养基的制备培养基的制备u制备制备选择培养基选择培养基（尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源）u制备制备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基对照作用对照作用为什么还要制备牛肉膏蛋为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？白胨培养基？4.4.进行实验进行实验 探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤取样土
8、壤取样A A 取样地：取样地：酸碱度接近中性酸碱度接近中性的的潮湿潮湿土壤中。土壤中。B B 取样：铲去表层土（一般取样：铲去表层土（一般3cm3cm左右）。左右）。细菌绝大部分分布在距地表细菌绝大部分分布在距地表3 38cm8cm的土壤的土壤层。层。4.4.进行实验进行实验 取土样时用的铁铲和取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前袋在使用前都需要灭菌都需要灭菌。操作。操作完成后，一定完成后，一定要洗手要洗手。注意注意 探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数4.4.进行实验进行实验样品的稀释与涂布平板样品的稀释与涂布平板不不
9、同同微微生生物物在在土土壤壤中中含含量量不不同同，分分离离不不同同的的微微生生物物采采用用不不同同的的稀稀释释度度，以保证获得以保证获得菌落数在菌落数在3030300300、适于计数的平板。、适于计数的平板。测测细菌细菌数：一般用数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液测测放线放线菌：一般用菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液测测真菌真菌数：一般用数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液在初次实验中，对于稀释的在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在保证
10、从中选择出菌落数在3030300300的平板进行计数？的平板进行计数？选选择择一一个个比比较较宽宽的的范范围围，将将1101103 31101107 7倍倍稀稀释释的的稀稀释释液液分分别别涂涂布布到到平平板板上上培培养养，以以保保证证能能从从中选择出菌落数在中选择出菌落数在3030300300的平板进行计数的平板进行计数 探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数(1)(1)(1)(1)每个浓度设置了每个浓度设置了 个平板，个平板，1 1、2 2、3 3平板是选择培养基（平板是选择培养基（实验），实验），4 4为为 培养基（培
11、养基（用以判断用以判断 选择培养基是否具有选择作用选择培养基是否具有选择作用）；）；(2)(2)(2)(2)另外，另外，整个实验还要设置整个实验还要设置 个空白个空白 对照平板：未接种的对照平板：未接种的_ _ _培养基，以培养基，以验证培养基验证培养基 中是否含有杂菌中是否含有杂菌。4 4重复重复牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨2 2 选择培养基和选择培养基和牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨样品的稀释与涂布平板样品的稀释与涂布平板4.4.进行实验进行实验 探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数【对点训练】请说明下列各组培养基的目的并预测
12、正常情况下各组的【对点训练】请说明下列各组培养基的目的并预测正常情况下各组的菌落生长情况。菌落生长情况。3 3组已接种的选择培养基：组已接种的选择培养基：_ 1 1组已接种的牛肉膏蛋白胨培养基：组已接种的牛肉膏蛋白胨培养基：_ 未接种的选择培养基：未接种的选择培养基：_ 未接种的牛肉膏蛋白胨培养基：未接种的牛肉膏蛋白胨培养基：_对土壤中分解尿素的细菌分离和计数；对土壤中分解尿素的细菌分离和计数；判断选择培养基是否具有选择作用；判断选择培养基是否具有选择作用；验证选择培养基中是否含有杂菌；验证选择培养基中是否含有杂菌；验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌；验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌；四
13、、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数可分离得到单菌落。可得到多种菌落。无菌落。无菌落。u培养条件：培养条件：不同种类不同种类的微生物，往往需要不同的的微生物，往往需要不同的培养温度培养温度和和培养时间培养时间。细菌一般在细菌一般在30303737的温度下培养的温度下培养1 12d2d。u观察：观察：每隔每隔 统计一次菌落数目，选取统计一次菌落数目，选取 时的记录作时的记录作为结果。防止为结果。防止 。u结果：结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如特征，如形状、大小和颜色形状、大小和颜色等。等。4.4.进行实验
14、进行实验注意事项：注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前好在使用前做好标记做好标记。例如，在标记培养皿时应该注。例如，在标记培养皿时应该注明明组别组别、培养、培养日期日期和平板上培养样品的和平板上培养样品的稀释度稀释度等；等；微生物的培养与观察微生物的培养与观察24h24h菌落数目稳定菌落数目稳定因培养时间不足而导致菌落数目遗漏因培养时间不足而导致菌落数目遗漏在在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗是能分解尿素的吗？不一定不一定。因为有些微生物可以利用其他微
15、生物的。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖代谢产物进行生长繁殖。探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。5.5.进一步探究进一步探究方法：在培养基中加入方法：在培养基中加入酚红酚红指示剂指示剂鉴别培养基鉴别培养基CO(NHCO(NH2 2)2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶2 2NHNH3 3+CO+CO2 2呈碱性，遇呈碱性，遇酚红酚红指示剂呈指示剂呈 红红 色。色
16、。探究探究实践实践 P18-19 P18-19 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数项目项目原理原理用途用途举例举例培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌若有，则菌落呈黑落呈黑紫紫色色，且带有金属光泽，且带有金属光泽)图示图示尿素分解菌大肠杆菌拓展延伸拓展延伸比较选择培
17、养基与鉴别培养基比较选择培养基与鉴别培养基加入不影响甚至促进目标微生物生加入不影响甚至促进目标微生物生长，而长，而抑制或阻止其他种类抑制或阻止其他种类微生物微生物生长的化学物质生长的化学物质加入某种加入某种指示剂或化学药品指示剂或化学药品(不影响不影响微生物正常生长微生物正常生长)，使，使微生物的某种微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应化学药品发生反应培养、分离出目标微生物培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物鉴别目标微生物选择培养基鉴别培养基M：代表稀释倍数；C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积
18、(mL)每g样品中的菌落数(CV)M例例1 1：某同学在稀释倍数为：某同学在稀释倍数为10106 6 的培养基中测得平板上菌落数的的培养基中测得平板上菌落数的平均数为平均数为234234，那么每，那么每g g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为液的体积为0.1mL)()0.1mL)()A.2.3410A.2.34108 8 B.2.3410B.2.34109 9 C.234 D.23.4 C.234 D.23.4 B三、微生物的数量测定 计算公式：稀释涂布平板法间接计数法间接计数法例2.某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀
19、释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学_；原因是_。2.乙同学_；原因是_。实验操作不合理实验操作不合理未设置重复实验组未设置重复实验组结果计算不合理结果计算不合理2121与另外两组数值相差太大，应舍去与另外两组数值相差太大，应舍去三、微生物的数量测定 方法1：稀释涂布平板法间接计数法间接计数法血细胞计数板：细菌计数板：缺点：不能区分死菌和活菌偏大不适
20、于对运动细菌的不适于对运动细菌的计数。计数。个体小的细菌在显微镜下难以个体小的细菌在显微镜下难以观察。观察。优点：快速、直观优点：快速、直观常用于常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数等的计数对对细菌等较小的细胞细菌等较小的细胞进行观察和计数；进行观察和计数；方法2：显微镜直接计数法 直接计数法直接计数法三、微生物的数量测定课堂小结微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法 稀释涂布平板法直接计数 计数
21、板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察实验设计1.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作,图乙是平板划线法的操作结果。下列叙述中错误的是()甲A.图甲中图甲中,涂布前要将涂布器灼烧涂布前要将涂布器灼烧,冷却后才能涂布菌液冷却后才能涂布菌液B.对于浓度较高的菌液对于浓度较高的菌液,如果稀释倍数仅为如果稀释倍数仅为1102,那么那么,所得的菌落不一定是所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成由单一的细胞或孢子繁殖而成C.图乙的培养皿中所得的菌落都是目的菌落图乙的培养皿中所得的菌落都是目的菌落,无须进行
22、进一步的鉴定筛选无须进行进一步的鉴定筛选D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端乙C稀释倍数稀释倍数11031104110511061107平均菌落数平均菌落数50036724826182.土壤是微生物的天然培养基,下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程,请根据右上图回答相关问题。(1)为分离出土壤中分解尿素的细菌为分离出土壤中分解尿素的细菌,应该用应该用的的选择培选择培养基进行分离养基进行分离,并加入并加入指示剂进行指示剂进行鉴别鉴别。(2)若取土样若取土样5 g,应加入应加入中配制成中配制成1101倍稀释的土壤溶液。因倍稀释的土壤溶液。
23、因土壤中细菌密度很大土壤中细菌密度很大,需要不断加以稀释需要不断加以稀释,配制成如图所示的不同浓度的土壤配制成如图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前溶液。取样稀释前,一定要一定要 以减少误差。从以减少误差。从11031107倍稀倍稀释的稀释液中分别吸取释的稀释液中分别吸取0.1 mL加到固体培养基上加到固体培养基上,用用 将其将其分分散散,每个浓度稀释液每个浓度稀释液至少接种至少接种个平板个平板,以以减少实验误差减少实验误差。(3)将接种的培养皿将接种的培养皿在在3037 的的箱中培养箱中培养12 d,观察并统观察并统计计,结果如下表所示。找出合适浓度结果如下表所示。找出合适浓度,推测出推测
24、出每克每克土样中的菌落土样中的菌落数为数为。以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源酚红酚红45 mL无菌水无菌水摇匀摇匀(振荡、混匀振荡、混匀)涂布器涂布器3倒置倒置恒温培养恒温培养菌落数菌落数2.48108一、概念检测 1 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（）（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降
25、解菌（）2 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数能推测出样品中的活菌数,原因是原因是()()A.菌落中的细菌数目是固定的 B.平板上的一个菌落就是一个细菌 C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌二、拓展应用1.1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分微生物，其中许多微生物能分解尿
26、素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够离出能够分解尿素的微生物分解尿素的微生物。提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。用用“尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源”的选择培养基的选择培养基进行培养进行培养创造无氧环境进行培养创造无氧环境进行培养2 2.地球上的植物每年产生的地球上的植物每年产生的纤维素纤维素超过超过7070亿吨，其中亿吨，其中 40%40%-60%60%能被土壤中某些微生物分能被土壤中某些微生物分解利用，
27、这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红刚果红是一种染料，它可以是一种染料，它可以与纤与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红刚果红与与纤维素纤维素形成形成红色复合红色复合物物
28、；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的为中心的透明圈透明圈(如下图所示如下图所示)。请回答下列问题。请回答下列问题。（1 1）现在要从土壤中分离）现在要从土壤中分离纤堆素分解菌纤堆素分解菌,请你给出详细的实验方案。请你给出详细的实验方案。（2 2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？（3 3）有同学说）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后经过一段时间后,再从已腐烂的再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。用用“纤维素为唯一碳源纤维素为唯一碳源”的选择培养基的选择培养基进行培养，进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。并在培养基加入刚果红进行鉴别。纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等这是这是人工设置人工设置适合纤维素分解菌生存的环境适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。二、拓展应用