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1、3.1 重组DNA技术的基本工具“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”“分子手术刀分子手术刀”实验：DNA的粗提取与鉴定教学目标教学目标1.阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L.的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胶试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以
2、作为鉴定DNA的试剂。目的要求 1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胶试剂对DNA进行鉴定。材料用具 1.材料：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。2.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。【实验：DNA的粗提取与鉴定】（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的
3、材料？操作时如何防止血液凝固？（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。如果是猪肝呢？鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。思考与讨论：【实验：DNA的粗提取与鉴定】称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。在上清液中加入体积相等的、溶液,静置23min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA。2.去除杂质3.D
4、NA的析出1.破碎细胞菜花研磨液上清液上清液预冷的酒精白色丝状物用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。析出析出DNA【实验：DNA的粗提取与鉴定】将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min4.DNA的鉴定二苯胺2mol/L的NaCl空白对照组：在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。思考：如何评价结果？看提取物颜色看与二苯胺反应颜色的深浅DNA纯度DNA的量【实验：DNA的粗提取与鉴定】DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理
5、或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNA00.14NaCI浓度（浓度（mol/L）DNA溶溶解解度度【实验：DNA的粗提取与鉴定】【实验：DNA的粗提取与鉴定】1.提取DNA的方法 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（1）提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）【实验：DNA的粗提
6、取与鉴定】【实验：DNA的粗提取与鉴定】2.实验原理（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精（2）DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高（3）DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色0DNA溶解度NaCl浓度0.14mol/L 2mol/L【实验：DNA的粗提取与鉴定】3.实验材料 新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等；95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、研磨液、二苯胺试剂和蒸馏水等。使构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于NaCl溶液中。洗涤剂SDS:使蛋白质变性与DNA分离;EDTA:是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;Tris:提
7、供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。【实验：DNA的粗提取与鉴定】4.实验步骤(1)称取约30g洋葱,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。(2)在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4冰箱中放置几分钟后,再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量过滤能用滤纸代替吗？不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。4.实验步骤(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积
8、分数为95%),静置23 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分;或者将溶液倒入塑料离心管中,在10000r/min的转速下离心5min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（1）冷却的酒精溶液(体积分数95)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。避免破坏DNA【实验：DNA的粗提取与鉴定】这一步的目的是蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。(4)取两支20mL的试管,各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液
9、中。然后,向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。4.实验步骤【实验：DNA的粗提取与鉴定】【请同学们补充完整以下实验步骤】试管编号A（对照组）B（实验组）步骤12mol/L的NaC1溶液5mL步骤2不进行任何处理步骤3步骤4沸水浴加热5min实验现象溶液不变蓝色实验结论加丝状物或沉淀物加4mL的二苯胺试剂溶液逐渐变蓝DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色【实验：DNA的粗提取与鉴定】【实验：DNA的粗提取与鉴定】5.结果分析与评价1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？观察提
10、取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。【实验：DNA的粗提取与鉴定】2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。5.结果分析与评价【进一步探究】本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提
11、取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。【进一步探究】（注意：（注意：不能选择不能选择哺乳动物成熟的红细胞哺乳动物成
12、熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有没有细胞核和线粒体，几乎不含细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）1.选材：2.试剂：研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L 的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液、二苯胺的配制方法 课本P117DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。小结一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶
13、切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端练习与应用C2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （）A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针A练习与应用二、拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。练习
14、与应用二、拓展应用2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切spe进行切割，B片段分别用限制酶Hind,Xba、EcoR和Xho进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶spe切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？Xba。因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端。练习与应用二、拓展应用(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。练习与应用