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1、 1 0 0 2 0 荚q!：Q 堕Q Z if1)C学位论文舒=垃凉 n 半细毛羊Q T L 定位初步研究李辉指导教师捌：名：吴登俊教授(四川农业大学)申请学位缴别：缝土专业名称：动塑运焦宣叠量鏊蕉论文提交日期：2 0 0 6 年5 月t 0 丌论文答辩日期：2 0 0 6 年6 月学位授，单位和日期：四川农业大学年月日答辩委员会主席：邱祥聘教授评闻人：赵查垄熬塑蕉扈眍夔援一王篷熬援一划型!盐熬援翌鳇煎壁摘要本研究以我国自行培育成功的凉山半细毛羊作为资源群体，对与实际生产密切相关的5 个体重性状和8 个羊毛性状进行了Q T L 连锁分析。体重性状分别是羔羊初生重、断奶重、断奶日增重、育成体重
2、和成年体重；8 个羊毛性状分别是断奶羊毛纤维长度、育成羊毛纤维长度、成年羊毛纤维长度、育成腹部羊毛纤维长度、成年腹部羊毛纤维长度、育成剪毛量成年剪毛量成年羊毛纤维直径。本研究选择了绵羊1、2、3、9 号染色体上的4 7 个微卫星标记，引物经荧光标记进行多重P C R 扩增，并在A B l 3 1 0 钡I 序仪上进行检测。根据测定结果，剔除了1 4个扩增效果不好的标记，选择了3 3 个标记进行分析。C e r v u s 2 O 软件统计结果显示所选微卫星标记在凉山半细毛羊群体中等位基因在3 2 2 个之间，群体杂合度为0 2 5 8 0 8 6 7，多态信息含量为0 2 4 5 0 8 5
3、3；各位点排除概率范围为0 1 3 7 0 7 2 8，累计排除概率达到了0 9 9 9 9 9 9。只有一个标记是低度多态，其他标记均呈现高度或中度多态性，为该群体分子水平上的研究提供了保障利用所选的微卫星标记对试验个体进行了亲子鉴定，所选标记的累积非父排除概率(c u m u l a t i v ep r o b a b i l i t yo fe x c l u s i o n。C P E)达到了9 9 9 9 9 9 9 9，最终确定了1 3 个家系，试验个体总数为1 0 0 3 只，其中父母代4 8 0 只、后代5 9 1 只，最大家系为i 8 8 家系(i 8 1 只)，最小家系为
4、$2 5 9(2 0 只)。对试验群体的5 9 1 个后裔的5 个体重性状和8 个羊毛性状进行了表型资料的简单统计分析。结果表明：初生和断奶性状与育成羊和成年羊的一些性状成显著相关，而且家系效应对某些性状有显著影响。通过对所选标记进行遗传连锁分析，构建了凉山半细毛羊基因组I、2、3、9号染色体的遗传连锁图谱。连锁图长度分别为3 0 1 6 c Y、3 1 6 9 c M、3 2 0 5 c M、1 7 3 7 c M，虽然4 条连锁图的长度与英国罗斯林研究所公布的最新的绵羊遗传连锁图不同，但标记顺序相同。利用Q T Le x p r e s s 在线分析程序，选择半同胞家系模型，用区间作图法对
5、影响上述凉山半细毛羊5 个体重性状和8 个羊毛性状的数量性状位点进行了Q T L 定位分析。Q T L 定位结果显示：在1 号染色体检测到了4 个Q T L 位点，分别是1 8 7 家系在2 5 5 c M 处检测到影响断奶重的Q T L，并达到了显著水平；在家系1 8 7 中2 4 9 c M 处检测到影响育成羊剪毛量的Q T L，在9 9 9 家系检测到2 个Q T L 位点。分别为在1 5 5 c M 处检测到的影响育成羊腹毛长的Q T L 和1 4 9 c 处检测到的影响成年羊腹毛长的Q T L 位点但后面3 个Q T L 位点未达到显著水平。在2 号染色傣竣测到了l l 令嚣L 往点
6、，分粼袅：在1 8 7 家系2 5 4 c M 处秘1 9 0 家系5 9 c M 她检测到影响扔生重的Q T L：在1 8 7 家系的8 6 c M 处检测到影响断奶日增重的Q T L；猩1 8 7 家系8 6 c M 处和1 9 0 客系6 7 c M 处检测到影响断奶泡长的Q T L：在1 9 0 家系6 3 c M 处捡测到影礁灏奶重的Q T L：在1 9 0 家系6 0 c M 处韶1 9 1 家蓉7 5 c M 处捡溅裂影晦育成荦剪毛量的艚乙#在1 9 1 家系7 9 c M 处检戚鲻影响成年攀剪毛量煞Q T L；在1 9 2 家系7 7 c M 处检测到影响育成重的Q T L：在
7、1 9 2 家系1 1 5 c M 处检测到影响育成羊毛长度豹Q T L。2 号染色体上检溺到豹1 1 个嚣L 位点龛部达到了照著承平。焱3 号染色俸徐溺到了9 令赋L 位点，分掰为：在1 8 7 家系7 9 c M 处检测翔影响成年羊嘏剪毛量的Q T L：在1 8 9 家系1 6 c M 处检测到的影响成年羊毛长度的Q T L；在1 9 0家系7 5 c M 处检测到影响断奶重鲍Q T L；在1 9 1 家系检测N 6 个Q T L 位点，在2 胡处检嚣到影嚷断魏霹矮踅的Q T L，在3 2 0 c M 处捡溅劐影嚷育成黧、育成羊毛妖、弯成莘腹毛长以及育成羊剪毛量的Q T L，在1 9 1
8、家系2 5 2 c M 处还检测到了影响荦毛纤维直径的Q T L，虽然该饭点未达到最落水平，但该位点与标记B M C l 0 0 9 高度遗锁，这与A l l a i n(1 9 9 6)报遴瓣结采一致。程9 号染色体焚检测到了1 2 个Q T L 位点。1 8 6 家系检测到了3 个Q T L 倪点，分别为：在1 7 3 c M 处影响初生重的Q T L：在O c M 处检测到的影响育成体重的Q T L，在5 c M楚捡灏翔了影嚷成冬羊俸重茨Q T L。1 8 7 家系投蘸裂7 5 令Q T L 篷焘，努裂必；在9 8 c d处检测到了影响成年羊体重的Q T L；1 5 1 c M 处检测到
9、了影响断奶羊毛长度的Q T L；在8 6 c M 处检测到了影响成年羊嘏长度的Q T L：在8 5 c M 处检测到了影响成年羊腹毛长发熬貔Q T L。在1 8 8 家系5 7 c M 簸捡弱到了影夔旁残羊薅鬃翡链L。在1 8 9 家系在O c M处检测到影响育成羊腹毛长、育成羊剪毛熬和羊毛喜裰3 个Q T L，该位点与标记E T H 2 2 5 连锁。零论文豹臻究懑进一步事蜜绵羊遗黄逐镁霭氆霸Q T L 定位豹臻究蠹窖，班鬻为本鼯种和其他绵羊品种在体燕和羊毛方搿进一步的选育提供参考；为更进一步的Q T L 精细定位和Q T L 分离克隆及揭示其作用机理提供依据，为候选基因的寻找积豢了资攒，为
10、在绵羊弯静巾早丑实现爨记辏蘩渗入稳檬记辘助途撵葜定初步基础。关键调：遗传连锁慧；Q T L 定使；疼出半纲泡羊：体重攘捩：羊毛键状嚣A B S T R A C TT h es u c c e s s f u lb r e e d i n go f L l a n g s h a ns e m 卜f i n ew o o ls h e e pw e r eu s e di nt h ep a p e r F i v ew e i g h tt r a i t sa n de i g h tw o o lt r a i t sw h c hw e r ec l o s er e l a t i v
11、 et ot h ep r a e u c a lp r o d u c t i o nw e r ee x e c u t e dQ T Ll i n k a g ea n a l y s i s F i v ew e i g h tt r a i t s，n a m e l yb i r t hw e l g h t(B W),w e a n m gw e l g h t(w w)，w e a m n gd a l l y 鲫n(W D G)，1 8-m o n t hw e l g h t(1 8 W)a n d3 0-m o n t hw e l g h t(3 0 W)，a n dt
12、 h ef o l l o w i n ge i g h tw o o lw,u t sw e r ea n a l y z e d W e a m n gs t a p l el e n g t h(W S L)，1 8-m o n t hs t a p l el e n g t h(1 8 S L)，3 0 m o n t hs t a p l el e n g t h(3 0 S L)，1 8-m o n t ha b d o m e ns t a p l el e n g t h(1 8 A S L)，3 0 m o n t ha b d o m e ns t a p l el e n
13、 g t h(3 0 A S L)，18-M o n t hf l e e c ew e i g h t(1 8 F W)，3 0 一m o n t hf l e e c ew e l g h t(3 0 F W)，3 0-m o n t hf i b e rd i a m e t e r(3 0 F D)aF o r t ys e v e nm i c r o s a t e l h t eD N Ac o n t a i n e di nm u l t i p l yP C Rs y s t e mw h i c hd i s t r i b u t e di nf o u rd l f
14、f e r e n tc h r o m o s o m e sw e r es e l e c t e d W eu s e df l u o r e s c e n tl a b e lf o rt h ep r i m e r sa n dd e t e c t e dt h e mo nA B l 3 1 0s e q u e n c e rA c c o r c h n gt ot h er e s u l t s t h i r t y t h r e ew e r es e l e c t e df o rt h i se x p e r i m e n t T h es t a
15、 t l S t l Cr e s u l t sb yC e r v u s 20s o f t w a r ed e m o n s t r a t e dt h a tt h ea l l e l eo ft h es e l e c t e dm i c r o s a t e l h t em a r k e r sI nt h eg r o u po fL i a n g s h a ns e m l f i n ew o o ls h e e pw a sf r o m3t o2 2 t h eh e t e r o z y g o s l t yo ft h e s em a
16、r k e r sw a sf r o m02 5 8t o08 6 7a n dt h ep o l y m o r p h I s mi n f o r m a t i o nc o n t e n tw a sf r o m02 4 5t O08 5 3，t h ep r o b a b i l i t yo fe x c l u s i o nf o re a c hl o c lw a sf r o m01 3 7t o07 2 8a n dc o m b i n e dp r o b a b i l i t y o fe x c l u s i o nw a su pt o09 9
17、 9 9 9 9A l lo t h e rm a r k e r sw e r eh i g ho rm i d d l ep o l y m o r p h l ce x c e p to 矗j)o 矗。碥a 3l o wp o l y m o r p h l c，w h i c hc o u l ds u b s t a n t i a l l yg u a r a n t e et h er e h a b I h t yo ft h er e s u l to ft h er e s e a r c ho nt h em o l e c u l el e v e lP a r e n
18、 t a g et e s t i n gw a sd o n ef o rt h ee x p e n m e n ti n d i v i d u a la c c o r d i n gt ot h es e l e c t e dm i c r o s a t e l h t em a r k e r s T h eC P Ew a su pt o9 9 9 9 9 9 9 9，a n d1 3a n c e s t r i e sw e r ee s t a b l i s h e d T h e r ew e r e 1 0 0 3i n d i v i d u a l si n
19、c l u d i n g4 8 0p a r e n t sa n d5 9 1p r o g e n i e sT h el a r g e s ta n c e s t r yw a sf a m i l y1 s s(1 S 1)，t h es m a l l e s ta n c e s t r yw a sf a m i l y$2 5 9(2 0)T h ep h e n o t y p e so ff i v ew e i g h tt r a i t sa n de l g h tw o o lt r m t sw e r ea n a l y z e ds i m p l
20、yb yS A S 61 2i nt h e5 9 1p r o g e n i e sT h ec o n s e q u e n c er e v e a l e dt h es l g m f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e nW Wa n d1 8 W、3 0 Wt h e r ew e r ee v i d e n c e sd e m o n s t r a t i n gt h em a i nf a c t o ro ff a m i l yh a ds i g n i f i c a n te f f e c to ns o
21、 m et r a i t sF o u rg e n e t i cl i n k a g em a p so fL l a n g s h a ns e m i f i n ew o o ls h e e p(C h r o m o s o m el，2，3，9)w e r ec o m p o s e db yg e n e t i cl i n k a g ea n a l y s i s T h el e n g t ho ft h e s em a p sw e r e3 0 16 c M、3 1 69 c M、3 2 05 c M、1 7 3 7 c MT h el e n g
22、t ho f f o u rm a pw a sm o r el o n g e rt h a nmt h el a t e s ts h e e pg e n e t i cl i n k a g em a pS M 42(s e xa v e r a g e)p u b l i s h e db yt h eB r i t i s hr o s h n er e s e a r c hc e n t e r,b u tt h e yh a dt h es a m es e q u e n c eQ T Le x p r e s so n-l i n ea n a l y s i sp r
23、o g r a mw a su s e da n dc h o o s eh a l f-s t hf a m d l e sm o d e l 拍eQ T Lm a p p i n ga n a l y s t so ft h ea b o v e-m e n t i o n e df i n ew e i g h tt r a i t sa n de i g h tw o o lt r a i t sw e r ee a r n e do u tb yI n t e r v a lm a p p i n gT h er e s u l ti n d i c a t e d F o u rQ
24、 T Lw e r ed e t e c t e dO l lC h r o m o s o m eo n eAl o c u sm f h i e n c m g 蝌w a sa t2 5 5 c Mi nf a m i l y1 8 7a n dw a su p 协s t g m f i c a n e el e v e l A n o t h e rQ T Li n f l u e n c i n gI g F Ww a sa t2 4 9 c Mi nf a m i l y1 8 7，T w oQ T LI l lf a m i l y9 9 91 8 A S La t1 5 5 c
25、M,3 0 A S La t1 4 9 c Mr e s p e c t i v e l y 曩掂p o s t e r i o r3Q T Ld 堪n o ta c h i e v et h es l g r a f i c a a c el e v e lE l e v e nQ T Lw 瑚罄d e t e c t e do nC h r o m o s o m et w oB Wa t2 5 4 c M 啦f a m i l y1 8 7a n da t5 9 c Mi nf a m i l y1 9 0，W D Ga t8 6 c Mmf a m d y l 8 7，W S La t
26、8 6 c Mmf a m i l y l 8 7a n da t6 7 c Mt nf a m i l y l 9 0，W Wa t6 3 c Mmf a m d y1 9 0，1 8 F Wa t6 0 c Mi nf a m a l y 1 9 0a n da t7 5 c Mmf r,m a l y1 9 1 3 0 F Wa t7 0 c MI nf a m i l y1 9 1，1 8 Wa 毫7 7 c M 攥f a m i l y1 9 2，l S S L 鑫l1 t 5 c Ml 磊f a m i l y1 9 2，r e s p e c t i v e l y A l lt
27、 h eQ T L si l lC h r o m o s o m e2w g l ea c h i e v e ds i g m f i c a n e el e v e l割酶r eh a dd e t e c t e d 瑚Q T Lo nC h r o m o s o m et h r e e 3 0 F Wa t7 9 c Mmf a m i l yl8 7，3 0 S La t1 6 c Mmf a m i l y1 8 9；W Wa t7 5 c Mmf a m i l y1 9 0；T w oQ T LW e r ed e t e c t e d1 1 3 f a m i l
28、y1 9 1W D 0a t2 c Ma n d1 8 W1 8 S L，1 8 A S La n d1 8 F WA 1 3 2 0 C m，A l t h o u g ht h el o c u sm f l u e n c m g3 0 勋a t2 5 2 e Ml nf a t m l y1 9 1w a sn o ts i g n i f i c a n t,i th i g h l yl i n k e dt oB M e l 鼢磁H c hw a sc o n s i s t e n t 黻像t h er e s u l to f A l l a i n(t 9 9 6)T w
29、e l v eQ T Lw e r ef o u n di nC h r o m o s o m em i l e I nf a m i l y18 6w ed e t e c t e dt h r e eQ T L；B Wa t1 7 3 c M，18 Wa t0 c M，3 0 Wa t5 e M,r e s p e c t i v e l yF i v eq r Lw e r ed e t e c t e d1 1 1f a m i l y1 8 7 3 0 Wa t9 8 c M，W S La 量1 5 1 c M，3 0 S La t8 6 c M,3 觚S La t8 5 c M,
30、1 8 W 鑫l5 7 擞i nf a m i l y1 8 8A t0 c Mi nf a m i l y1 8 9,w ef o u n dt h r e eQ T Li n f l u e n c i n g1 8 A S L，1 8 F Wa n d3 0 F D t h e s el o c il i n k e dv o t hm a r k e rE T H 2 2 5翔es t u d yo ft h i sp a p e rw i l te n r i c ht h er e s e a r c hc o n t e n to fs h e e pg e n e t i cl
31、 i n k a g em a pa n dQ T Lm a p p i n g,t op r o v i d er e f c r e n e ef o r 内r d 暗fs e l e c t i o no fL l a n g s h a ns e m i-f i n ew o o ls h e e pa n do t h e rO v m es p e c i e si l lt h ea s p e c to fw e l g h ta n dw o o l，t ol a yaf o u n d a t i o nf o rr e f i n e dQ T Lm a p p i n
32、g，s e g r e g a t ec l o n i n ga n dt or e v e a lI t Sm e c h a n i s mo fa O a o n，t oa c c u m u l a t ed a t af o rs e a r c h i n gc a n&d a t eg e n ea n dt oe s t a b h s hp r e p a r a t o r yb a s ef o rm a r k e ra s s：s tp e n e t r a t i o na n dm a r k e ra s S I S ts e l e c t i o nl
33、ns h e e pb r e e d i n gK e yw o r d s：G e n e t i cl i n k a g em 印；Q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i：L l a n g s h a ns e m t-f i n ew o o lS h e e p：W e l g h tt r a i t s：W o o lt r a i t s论文独创性声明本人郑重声明：所量交的学位论文是我个人在导颊指导下遴行研究工作所取褥的成果。尽我所知，除了文中特别嬲以标注嗣致谢静地方外，学位论文中不包含其能个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包
34、含为获得因川农业大学或其它教育机构豹学位或证书所使用过的材料。与我一溜工作的闷志对本研究鼹徽的任何舞黻均己在论文中作了明确的说明并表示了谢慧。研究生签名拗孚沙-6 如谜黾关于论文使用授权的声明本人完全了解匪川农盐大学有关保留、使翔学拉论文麴援定，群：学校有权保裔并向国家有关部f 1 或机构送交论文的复印饽积电子舨，允许论文被燕翔车口借阅，可以采用影印、绦印或扫描等复铡手段保存、汇编学位论文。冠意四川农业大学可以用不翘方式在不翔媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名，。革s 睦z 3 钍创。，年占月害甚橱辫第一部分文献综述数量性状和质量性状的遗传研究在起始时间上几乎没有什
35、么先后之分。然而早在1 8 6 5 年孟德尔就根据质量性状的研究结果提出了分离和独立分配规律，而对于数量性状直到1 9 0 9 年才由N d s s o n E h l e 提出了多基因假说【l】。1 9 7 5 年G e l d e r m a n提出了控制数量性状的数量性状位点(Q u a n t R a t w eT r a i tL o c i，Q T L)的概念，他认为Q T L 是占据染色体某一特定区段，对数量性状的变异有较大影响的单一基因或紧密连锁的基因簇，一个数量性状可受到多个基因簇的影响f 2 1。传统的数量遗传学采用数理统计的方法把控制某个性状的多个基因作为一个整体进行研究
36、，这种方法在长期的育种实践中为动植物的遗传改良作出了重要贡献，但不可否认的是这种方法无法鉴别出单个数量基因以及与之有关的染色体片段，更难确定数量性状位点在粱色体上的位置及其与其他基因的关系，因而也无法采用现代分子遗传学所发展的基因分离，克隆等方法对数量性状进行遗传操纵【3】。解决这一问题的突破口在于能否将影响数量性状的多个基因剖分开来，将其定位在染色体上，并最终确定与之有关的D N A 序列。借助于已知染色体座位的遗传标记去追踪每一染色体片段的传递，不仅可以对Q T L 所在的基因组进行一段一段的分析，而且可以直接测量过去所不能鉴别的各染色体区段的效应，在理论上，通过这种方法可绘制出数量性状的
37、所有主要基因的详细连锁图，从而确定其在染色体上的位置、单个效应及互作效应，这就向Q T L 分子图谱的制作以及进而为物理图谱的制作和数量性状的遗传操纵迈开了第一步。完整和饱和分子图谱的建立，已有可能将多个数量基因剖分为离散的孟德尔因子，并借助于现代分子遗传学的方法对其进行遗传操作【4 l。数量性状位点单个基因的识别将能够改进选择性育种的效率，尤其是对低遗传力性状或限性性状，也使转基因技术应用于数量性状成为可能，对于与疾病有关的性状的研究还可以导致预防方法的改进等。目前借助分子生物学技术进行Q T L 检测的方法有两类，一类是标记Q T L 连锁分析，也称为基因组扫描：另一类是候选基因分析。标记
38、Q T L 连锁分析是基于遗传标记等位基因与Q T L 等位基因之间的连锁不平衡关系，通过对遗传标记从亲代到子代遗传过程的追踪以及它们在群体中的分离与数量性状表现之间的关系的分析，来判断是否有Q T L 存在、它们在染色体上的相对位置以及它们的效应大小，因而这类方法的前提是：要有理想的遗传标记；要有合适的群体用于进行分析：在该群体中仍有在分离的Q T L。标记一Q T L 连锁分析的基本步骤是：进行试验设诗；震来迸纷据记Q T L 逡镶分辑熬爨髂鬻霰豫终瓷源群终，耄謦在一般熬家畜群体中标记与Q T L 可能处予连锁平衡状态，所以需要设计特定的资源群体，以产缴足够的连锁不平衡：选择遗传标记：根据
39、所选择的资源群体，试验经费、技零零孚、工终条传等选择逶巍豹类垄窝数瓣赘标记：毁集鼗蕹：_ 燕要莠嚣方面的数据来源：一是分子遗传标记基因型的测定，二是对需要检测鼬数量性状表型值的测定；构建标记连锁图谱：判断所测定的标记属于哪一个连锁群(染色钵)，结诗标记舞瓣裙对距离 菝重组率蓑鬻蓬表忝)及拣记载 鬟鬏謦；Q T L的检测与参数估计：根据已经确定的遗传连锁图谱，利用测得的标记蒺因型信息和表烈值，通过统计分析对Q T L 进行检测及其有关参数(在染色体上的位置、效应大夸等)茨毽谤【那。标记Q 瓴连镁分耩麴整今滚程羹圈1 1。瞬l-IQ T L 定位的源程霉F i gI-IT h ep r o c e
40、 s so f q u a n h t a t w et r a t tl o c lm a p p m g本联究采用懿是全基因组4 薯描法进行Q 飘检测，所以下嚣几节就囊要从Q T L静检测所需要韵逶传标记、瓷游群体、表篓数据、遗传遂锁图帮Q 骶。稔测方法的研究进展等各方顾进行综述。l 徽卫星标记麓研究进震及应用微卫星1 3 N A(r r u c r o s a t e l h t e)也叫做短串联蹩复序列(s h o r t t a q d c mr e p e a t，S T R)或简单重复序列(S t r n p l eS e q u e n c eR e p e a t，S S R
41、)悬一类广泛存在于真核生物基因组中的D N A 攀联重复謦魏。S k i n n e r 等t 5(1 9 7 4)在寄屠鼹中识别的卫艨D N A 重复序刿是(T A G G)(A T C C)，此后又有许多研究者对这种类型的D N A 在人类，动物，植物和真菌中的产生与分布做了许多研究工作。T a u t z 等 7】(1 9 8 4)发现这种短的重复序列是真核生物独有的，并称之为“简单重复序列”。后来，L l t t-等1 8 1 09 8 9)在心肌肌动蛋白的基因内扩增了一种二核苷酸重复，首先使用了“微卫星”这个名称。微卫星以一个l-6b p 的短核苷酸序列(核心序列)为基本单位，呈1
42、6 一_ 6 0 次串联重复状随机分布于生物体整个基因组。微卫星核心序列按碱基数目可分为单一、二、三四、五、六核苷酸，二、三、四核苷酸重复序列，因多态性丰富而受到人们高度重视和应用【9】。W e b e r 还根据微卫星本身的结构将其分成3 类，即完全、不完全和复合的微卫星。完全的微卫星是由不中断的重复单位所构成；不完全的微卫星是指重复单位中间有3 个以下的非重复碱基，且两端不中断部分的重复数大于3：复合的微卫星则是指有2 类或2 类以上的串联重复单位，由不多于3 个连续的非重复碱基分隔开，但各不中断的重复单位数大予或等于5，以上3 种微卫星在基因组分布的比例随物种而有差异l l o l。，1
43、 1 微卫星标记的形成与消亡对微卫星的突变研究有多种方法，如直接考察系统发生过程、对等位基因进行测序、绘制系统发生过程中基因的大小和序列。关于微卫星D N A 的突变机理也有很多种，但是最为接受的是L e v l n s o n 等】(1 9 8 7)提出的复制滑动或称链屑动错配或D N A 聚合酶屑动模型，在该模型中，D N A 复制中的引物链或模板链发生暂时的分离，引物链3 端的重复单位与模板下游的重复单位互补再杂交，形成错排的突出环。如果错排没有被修复，随着引物链延伸，形成比模板长的新生链。反之如果错排发生在模板链的上游，新链的序列就会变短，如图1 2 所示。a Jt 蔓序刊增长佃)重蔓
44、序刊缩短12，214正常i分离l复性-宁-r f=_ f；_ r f f 冒3，p-r r i 广1；-一r 万气气气育。珲气飞，气书r：!S 己!：!：!生4 生成与幔括长!三-!：毛!f r 广气言-r r r r F 废不哪的新笸：。留r r r r 广；育。Y图1 2 微卫星的复制滑动模型F i gl-2T h er e p h c a t m ns l i p p a g em o d e lo fm t c r o s a t e l h t e|也肖人认为微激星D N A 的突变是通过姐妹染色单体或同源染色体的交换或萋嚣转换产生熬，毽爱下列事实似乎菸不支持遮秘援理：丈多数突变瓣等
45、疰基因的侧翼序列并不发生重组，突变只是发生强等位基因内部；Y 染色体和常染色体S T R 的突变率和突变方式没裔差异，提示突变不需要经过同源染色体的重组；足乎掰蠢熬S T R 突变都霉鼓溺复裁潺动壤鬃解释f 1 2 。V a l d a s 等认为从统计学角度葡，微卫星的产生采用的怒逐步突交模式，即每一次突变均增加一个绒数个重复单位，从而孕效一个新的镣位基因的出现，但这静交再会受笺菜秘终寒，蔹覆囊雩警会一定熬燕悫分枣。这魏蔽裁因素霹戆莠瑷下一些：(1)基因转换：(2)偏向性突变；(3)选择；(4)微卫星熬复单位存在缺陷；(5)重复区域碱基的随机突变【1 3 l。S t e w a r t 等(
46、1 9 9 6)通过绘制两个微卫星序列的系统发生，虽零了微至星豹形藏蓬程，撵逛透纯过程串赣墨羹豹产生爨裁是嚣耪突交过程的结合，第一个突变为滑动错鬻已提供足够长度的重复数，第二个突亵悬通过滑动错配造成重复区域的长度变异。S c h l o t t e r e 等(1 9 9 8)通过模拟与实验棚结合显示徽圣曩瓣突交事荨葵羹复数量正穗关【H】，B a e h t r o y 等(2 0 0 0)瓣臻究遴一步表裙缀卫星的突变发生还受基因组中微融星的密度影响，微卫星的侧翼序列也会影响滑动错配的修复。T a y l o r 等(1 9 9 9)绳出徽圣星瓣薤亡学说，捂窭镦圣羹懿溃亡过程毽氇括嚣令相互结合
47、的突变过稷。第一个突变是重复区断裂从而阻止滑动错配过稷的发生和稳定现有重复，第纛个突变是包括太重复区域的删除过程，经过这两个过程就会使一个徽卫星等霞蒸医获萋嚣缀举渣失雏”。1 2 微卫星标记的分布和功能徽瀑星D N A f-泛疆蟪分毒予备耪真核生钧基嚣组孛，不仅分布于蕊爨之闻魏闻蕊区鞍基因懿内禽予中国诚，1 9 9 4)，也分布予基医鲍井京子和调控元巾(N a n d a，1 9 9 1)在真核生物中大约每隔1 0。5 0 k b 就存谯1 个微卫星，在哺乳类动物中似乎每个基嚣郡存在至少令皴里鬃标记(N l e l l a s，1 9 9 5)。攥然诗在崤乳动携基医组中徽曩凝的平均拷贝数为5
48、万l O 万个”“。微卫星D N A 名E 真核生物基因组中的确切功能目前尚不清楚。目前般认为宅参每逢传重缓，静致逮建交舅i”l。K i n g 潮-孩彗酸燕复霹戆在基嚣维孛充当自然发生的特异憔位点突变调节因子的角色。目前，已发现微卫星能参与遗传4物质的结构改变、基因调控及细胞分化过程，它有自身特异的结合蛋白，并能直接编码蛋白质，是一种菲常活跃的碱基序列。微卫星在促进染色体凝集、维持染色体结构等方面也有作用，可参与染色体折叠、端粒的形成等【1 8 1。一些微卫星还可能与致盲性、性别分化、x 染色体失活有关。微卫星的序列变化多样，在基因组中可能通过改变D N A 结构或通过结合特异蛋白来发挥作用
49、 1 9 1。1 3 微卫星位点的分离方法对已知微卫星位点，只要按侧翼序列设计引物，进行P C R 扩增，则不同等位基因由于重复数不同形成多态性，对未知微卫星位点的分离方法有：1 3 1 原位杂交法这种方法的基本步骤为：(1)以柯斯质粒或其它载体构建整个基因组文库，或者通过流式细胞仪分离单个染色体，再进行分带后染色体显微切割，构建单个染色体或部分染色体基因组文库；(2)以耳标微卫星，如(C A)1 0 为探针，通过S o u t h e r n杂交筛选阳性克隆，阳性克隆用酶消化后以(C A)1 0 等为探针，测定微卫星的数目；(3)提取质粒后利用载体插入座位两瑞的已知序列设计引物去测定插入片断
50、序列，最后在微卫星两端选出适当的引物即可用于测定基因组样品，引物一般长度为2 0 2 5 个碱基，产物为1 0 0 2 0 0b p。(4)以微卫星探针与作G 带后的中期染色体进行原位杂交，即可确定微卫星在染色体上的物理位置【2 0 1。这种方法较为繁琐，且花费很大。1 3 2R A M P 分离法首先以单一随意引物或微卫星引物通过P C R 扩增总D N A，扩增产物进行电泳分离、照相，再以3 2 P 标记的微卫星探针实行原位杂交，这种方法实际上是把R A P D和传统分离新微卫星的方法结合起来，与常规R A P D 不同的是，所用引物是微卫星引物。R a m s e r 等(1 9 9 7