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1、基因工程菌基因工程菌L-精氨酸简介精氨酸简介 L-精氨酸精氨酸(L-Arginine,简称简称L-Arg)是一种非必需氨基酸是一种非必需氨基酸,是生物体是生物体尿系循环的一种重要中间代谢产物尿系循环的一种重要中间代谢产物,具有多种独特的生理和药理作用。在具有多种独特的生理和药理作用。在正常情况下正常情况下,机体能自身合成机体能自身合成L-Arg,但在饥饿、损伤、疾病、应急状态及但在饥饿、损伤、疾病、应急状态及生长阶段时生长阶段时,机体对机体对L-Arg 的需求超过的需求超过了自身合成的能力了自身合成的能力,因此及时补充外因此及时补充外源性源性L-Arg有利于提高机体的免疫能有利于提高机体的免疫
2、能力。此外力。此外,研究发现研究发现L-Arg 对氨中毒性对氨中毒性肝昏迷及病毒性肝炎有显著疗效肝昏迷及病毒性肝炎有显著疗效;随着随着L-Arg-NO(一氧化氮一氧化氮)途径在临床上途径在临床上研究的不断深入研究的不断深入,发现发现L-Arg 还具有抗还具有抗动脉粥样硬化、防治高血压及心力衰动脉粥样硬化、防治高血压及心力衰竭等作用竭等作用L-精氨酸简介精氨酸简介 传统生产传统生产L-Arg 的高产菌株大多的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得采用诱变筛选的方法获得,但此法有盲但此法有盲目性高、工作量大目性高、工作量大,且存在突变株生理且存在突变株生理失调，易退化等局限性。失调，易退化等局限性。D
3、NA 重组技术出现以后重组技术出现以后,人们开人们开始探索利用始探索利用DNA 重组技术调控合成重组技术调控合成Arg 代谢途径代谢途径,以达到提高以达到提高Arg 产量的产量的目的目的L-精氨酸生物合成及其代谢途径精氨酸生物合成及其代谢途径 Arg 的生物合成是通过细胞内的的生物合成是通过细胞内的代谢网络进行的代谢网络进行的,该代谢网络由众多的该代谢网络由众多的酶催化相互关联的一系列化学反应以酶催化相互关联的一系列化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。及特异性的膜转移系统所构成。1991年年,Bailey 提出了代谢工程学提出了代谢工程学说说,即利用分子生物学原理系统地分析即利用分子生物学原
4、理系统地分析细胞的代谢网络细胞的代谢网络,并通过并通过DNA 重组技重组技术合理设计细胞代谢途径及对其进行术合理设计细胞代谢途径及对其进行遗传修饰遗传修饰,改造细胞本身固有的代谢途改造细胞本身固有的代谢途径径,提高终产物的产量提高终产物的产量提高提高L-精氨酸产量的策略精氨酸产量的策略1 提高酶量提高酶量 2 改变代谢流改变代谢流提高酶量提高酶量 1.1提高关键酶酶量提高关键酶酶量 1.2 解除阻遏蛋白和解除阻遏蛋白和Arg 对其生物合对其生物合成途径的反馈阻遏成途径的反馈阻遏 1.2.1Arg boxes 的多拷贝竞争性结合阻遏蛋白 1.2.2Arg boxes 的突变解除阻遏蛋白及Arg
5、的反馈阻遏 1.2.3利用阻遏蛋白对异源的Arg boxes不识别,解除阻遏反馈 1.2.4argR 的突变降低对Arg boxes 的亲和性提高关键酶酶量提高关键酶酶量借助于基因克隆与表达技术借助于基因克隆与表达技术,将将Arg 生生物合成途径中的关键酶编码基因导入物合成途径中的关键酶编码基因导入生产菌中生产菌中,通过增加基因剂量和更换表通过增加基因剂量和更换表达调控元件达调控元件,强化表达。导入的关键酶强化表达。导入的关键酶基因既可以是生产菌自身的内源基因基因既可以是生产菌自身的内源基因,也可是来自非生产菌的外源基因。也可是来自非生产菌的外源基因。在实验中采用棒状杆菌属及短棒杆菌在实验中采
6、用棒状杆菌属及短棒杆菌属的菌为宿主属的菌为宿主,以实验中构建的穿梭质以实验中构建的穿梭质粒粒p Enar1 为载体为载体,携载来自于大肠杆携载来自于大肠杆菌中编码乙酰谷氨酸激酶的基因菌中编码乙酰谷氨酸激酶的基因argB 来提高来提高Arg产量产量,实现了利用异源基因实现了利用异源基因在棒状杆菌和短棒杆菌中的生产在棒状杆菌和短棒杆菌中的生产提高关键酶酶量提高关键酶酶量实验发现实验发现,在野生型棒杆菌属及短棒杆在野生型棒杆菌属及短棒杆菌属的菌中菌属的菌中,质粒质粒p Earg1 显示了对显示了对Arg 产量的贡献产量的贡献;然而然而,Arg 生产突变生产突变菌显示导入菌显示导入p Earg1质粒后
7、质粒后,Arg 的产的产量更为提高量更为提高,Arg 产量最高为产量最高为118 mg/mL解除阻遏蛋白和解除阻遏蛋白和Arg 对其生物合成途径的反馈阻遏对其生物合成途径的反馈阻遏细菌中与细菌中与L-精氨酸生物合成途径相关精氨酸生物合成途径相关的酶受到由的酶受到由argR 编码的阻遏蛋白的调编码的阻遏蛋白的调控控,受到受到Arg 的共阻遏的共阻遏,因此要提高精因此要提高精氨酸的产量氨酸的产量,可以采用适当方法减轻或可以采用适当方法减轻或摆脱阻遏蛋白及摆脱阻遏蛋白及Arg 对合成对合成Arg 酶的酶的基因的调控基因的调控,最大限度的解除最大限度的解除Arg 及阻及阻遏蛋白对其生物途径造成的反馈阻
8、遏遏蛋白对其生物途径造成的反馈阻遏,提高酶的表达提高酶的表达,从而达到提高从而达到提高Arg产量产量的目的的目的1.2.1Arg boxes 的多拷贝竞争性结合阻遏蛋白的多拷贝竞争性结合阻遏蛋白当发酵液中当发酵液中Arg 量达到一定时量达到一定时,会促使会促使阻遏蛋白与阻遏蛋白与Arg boxes的结合的结合,从而阻从而阻遏编码生产遏编码生产Arg 相关酶的表达相关酶的表达;因此因此,可以通过可以通过Arg boxes 的多拷贝竞争性的多拷贝竞争性结合阻遏蛋白结合阻遏蛋白,达到提高达到提高Arg 产量的目产量的目的的在实验中在实验中,将大肠杆菌中将大肠杆菌中argI的的Arg boxes 克隆
9、进克隆进pLL K12 质粒质粒,Arg boxes 的多拷贝促使的多拷贝促使Arg 阻遏子放弃阻遏子放弃了对了对Arg调节子的阻遏调节子的阻遏,从而相应提高从而相应提高Arg 产量。产量。1.2.2Arg boxes 的突变解除阻遏蛋白及的突变解除阻遏蛋白及Arg 的反馈阻遏的反馈阻遏Arg boxes 的突变包括的突变包括Arg boxes 自身的突自身的突变变,也包括相邻也包括相邻2 个个Arg boxes 距离的改变距离的改变,相相邻邻Arg boxes 距离的改变也影响阻遏蛋白对距离的改变也影响阻遏蛋白对Arg boxes 的亲和性。的亲和性。Kat sumata 等构建一系列穿梭质
10、粒等构建一系列穿梭质粒,利用化利用化学突变剂学突变剂Arg-营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株,即其中一个合即其中一个合成成Arg 的酶发生缺失的酶发生缺失,发现此突变菌中其他合发现此突变菌中其他合成成Arg 的途径酶对的途径酶对Arg 的反馈阻遏不敏感的反馈阻遏不敏感,再再用质粒携载编码此类酶的遗传信息转入棒杆用质粒携载编码此类酶的遗传信息转入棒杆菌属或短棒杆菌属菌内菌属或短棒杆菌属菌内,从而提高从而提高Arg 产量。产量。（大肠杆菌其合成（大肠杆菌其合成Arg 的酶对的酶对Arg 的反馈阻的反馈阻遏不敏感的原因是编码基因的遏不敏感的原因是编码基因的5非编码区的非编码区的Arg boxes 发生了
11、突变发生了突变,使得使得argR 编码的阻编码的阻遏蛋白对遏蛋白对Arg boxes 的亲和性下降所至。）的亲和性下降所至。）通过共同途径代谢前体物的积累通过共同途径代谢前体物的积累,打断打断竞争的代谢支路和构建代谢旁路等手竞争的代谢支路和构建代谢旁路等手段段,可以改变代谢流可以改变代谢流,使其向着希望的使其向着希望的途径运行。对共同途径的研究在于代途径运行。对共同途径的研究在于代谢过程的关键分支点。谢过程的关键分支点。在在Arg 合成途径中合成途径中,谷氨酸为合成脯氨谷氨酸为合成脯氨酸和酸和Arg 的共同前体物的共同前体物,氨甲酰磷酸是氨甲酰磷酸是合成精氨酸和嘧啶的共同前体物合成精氨酸和嘧啶
12、的共同前体物,为提为提高高Arg 的产量可以采用基因敲除等方的产量可以采用基因敲除等方法使谷氨酸合成为脯氨酸的酶及氨甲法使谷氨酸合成为脯氨酸的酶及氨甲酰磷酸合成为嘧啶的酶失活酰磷酸合成为嘧啶的酶失活,从而为从而为Arg 的生产提供更多的原料。的生产提供更多的原料。结束语结束语在对大肠杆菌载体在对大肠杆菌载体-受体系统广泛而受体系统广泛而深入研究的基础上深入研究的基础上,对棒状杆菌属的遗对棒状杆菌属的遗传背景、代谢途径和载体传背景、代谢途径和载体-受体系统受体系统的研究也取得了长足进展的研究也取得了长足进展,这为利用基这为利用基因工程手段提高因工程手段提高Arg的产量打下了坚的产量打下了坚实的基
13、础。实的基础。基因工程技术日新月异的发展为生物基因工程技术日新月异的发展为生物合成合成Arg 的基因工程菌的构建提供了的基因工程菌的构建提供了新的思路。新的思路。知识小卡片知识小卡片基因敲除基因敲除该技术是上个世纪该技术是上个世纪90年代出现的最新年代出现的最新外源外源DNA导入技术。基因敲除是基因导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源重组。指外源DNA与受体细胞基因组与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相组，从而代替受体细胞基因组中的相同同/相似的基因序列，整合入受体细胞相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。它克服了随机整合的盲的基因组中。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法改造生物遗传物质的方法。