环境毒理学常用研究方法.ppt

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1、第八章第八章 环境毒理学常用环境毒理学常用研究方法研究方法毒理学研究方法毒理学研究方法体内实验体内实验 in vivo tests体外实验体外实验 in vitro tests(1)(1)流行病调查流行病调查/临床观察临床观察(2)(2)动物实验动物实验第一节第一节 实验准备实验准备1.1 1.1 动物的准备动物的准备 选择实验动物选择实验动物 编号与标记编号与标记 固定与麻醉固定与麻醉（1 1）选择实验动物）选择实验动物黏膜刺激黏膜刺激高血压高血压1 1）种属的选择原则）种属的选择原则在机体反应上与人体近似在机体反应上与人体近似易获得、易饲养、易管理易获得、易饲养、易管理敏感、合适敏感、合适

2、实验资料实验资料大鼠致癌大鼠致癌豚鼠过敏反应豚鼠过敏反应常用动物介绍常用动物介绍猫猫 气体、蒸气对黏膜的刺激气体、蒸气对黏膜的刺激豚鼠或兔豚鼠或兔 皮肤皮肤豚鼠豚鼠 过敏性反应过敏性反应猫、狗、兔猫、狗、兔 呕吐呕吐兔和猫兔和猫 体温体温狗、兔、大鼠狗、兔、大鼠 血压血压大鼠和小鼠大鼠和小鼠 致癌致癌 小鼠小鼠 慢性中毒对脏器的损害慢性中毒对脏器的损害 2 2）个体选择）个体选择年龄：年龄：幼年幼年 成年，急性实验成年，急性实验成年成年性别：性别：无特殊要求就雌雄各半无特殊要求就雌雄各半生理状态：生理状态：如怀孕、哺乳如怀孕、哺乳健康状态：健康状态：检查、预检检查、预检（2 2）实验动物的标记

3、编号）实验动物的标记编号染色、烙印、号牌染色、烙印、号牌大动物：记录外表和毛色大动物：记录外表和毛色（3 3）实验动物的捕捉及固定）实验动物的捕捉及固定做好防护做好防护 戴厚手套戴厚手套用器具固定用器具固定（4 4）实验动物的随机分组）实验动物的随机分组分分2 2组：组：任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录1414个数个数 再抄录一个数字为再抄录一个数字为78，因为归入，因为归入A组的小鼠有组的小鼠有8只，故以只，故以8除，除，得余数得余数6。于是把第。于是把第6个个A（即编写为第（即编写为第12号的小鼠）划给号的小鼠）划给B组组 分分3 3组：组：

4、再取一个随机数除以再取一个随机数除以6 6，看余数，看余数（5 5）实验动物的麻醉）实验动物的麻醉动外科手术动外科手术避免剧烈挣扎避免剧烈挣扎麻醉药物：麻醉药物：乙醚乙醚（1）全身麻醉）全身麻醉 a）吸入法：）吸入法：开放法、封闭法挥发性开放法、封闭法挥发性 b）腹腔和静脉给药麻醉法）腹腔和静脉给药麻醉法非挥发性非挥发性（2）局部麻醉）局部麻醉 a）猫：一般应用）猫：一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因盐酸普鲁卡因 注射。粘膜表面麻醉宜用注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因盐酸可卡因b）兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入）兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸盐酸 可卡因溶液，数秒钟即可出现

5、麻醉可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉c）狗：用）狗：用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉 表面麻醉可用表面麻醉可用2%盐酸可卡因盐酸可卡因麻醉注意事项麻醉注意事项（1）静脉注射必须缓慢）静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。（2）麻醉时需注意保温）麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节。麻醉期间，动物的体温调节机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有：

6、机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有：实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法加温都应根据动物的肛门体温而定。加温都应根据动物的肛门体温而定。（3）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。热至动物体温水平。1.2 1.2 毒物的准备毒物的准备（1 1）了解毒物的物理常数）了解毒物的物理常数 密度、溶解度、蒸汽压、熔点、密度、溶解度、蒸汽压、熔点、沸点、油沸点、油/水分配系数等水分配系数等（2 2）剂型：）剂型：毒性高、刺激性大稀释毒性高、刺激性大稀释 固态溶液、软膏固态溶

7、液、软膏（3 3）溶剂：）溶剂：本身毒性很小或无毒本身毒性很小或无毒 不与受检毒物产生增毒或不与受检毒物产生增毒或 减毒作用减毒作用 不影响毒物吸收不影响毒物吸收 无特殊的刺激性或气味无特殊的刺激性或气味1.3 1.3 生物材料的采集和制备生物材料的采集和制备（1 1）血液的采集）血液的采集 需求少需求少 刺破组织取毛细血管的血刺破组织取毛细血管的血 需求多需求多 静脉采血、动脉静脉采血、动脉 注意：注意：光线、温度、器皿消毒、光线、温度、器皿消毒、抗凝剂抗凝剂割（剪）尾取血割（剪）尾取血眼眶静脉丛采血眼眶静脉丛采血断头取血断头取血颈动脉取血颈动脉取血腹主动脉腹主动脉股动（静）脉取血股动（静）

8、脉取血（2 2）尿液的收集）尿液的收集连续收集连续收集 在代谢笼下配置粪尿分离漏斗在代谢笼下配置粪尿分离漏斗一次性尿液收集一次性尿液收集 逼尿法、导尿法、输尿管插管法逼尿法、导尿法、输尿管插管法 剖腹采集尿液、提鼠采集尿液剖腹采集尿液、提鼠采集尿液 尿液收集注意事项尿液收集注意事项实验期间膳食一致，特定时间完成收集实验期间膳食一致，特定时间完成收集防止尿液的污染防止尿液的污染标本迅速测定或冷冻保存标本迅速测定或冷冻保存避免器皿污染避免器皿污染灌喂水或青菜满足尿量需求灌喂水或青菜满足尿量需求（3 3）粪便的收集）粪便的收集代谢笼、粪尿分离器代谢笼、粪尿分离器外观形态新鲜、完整，分析时取内外观形态

9、新鲜、完整，分析时取内层粪便层粪便器皿干净器皿干净（4 4）呼出气的收集）呼出气的收集研究毒物的吸收代谢和对肺功能的研究毒物的吸收代谢和对肺功能的影响影响动物需固定动物需固定（5 5）组织匀浆的制备组织匀浆的制备酶：酶：取样洗净研磨离心取样洗净研磨离心 测定测定用于毒物的测定用于毒物的测定1.4 1.4 预备试验预备试验（1 1）选择合适的实验动物）选择合适的实验动物（2 2）设计染毒剂量及其分组）设计染毒剂量及其分组（3 3）操作技术的检验和训练）操作技术的检验和训练（4 4）发现新线索、新指标）发现新线索、新指标第二节第二节 常用染毒技术常用染毒技术2.2.常用染毒途径常用染毒途径吸入染毒

10、、经皮肤染毒吸入染毒、经皮肤染毒最重要的最重要的灌胃灌胃气管注入气管注入注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）根据根据实验目的实验目的进行选择，同时考虑：进行选择，同时考虑：（1 1）人群接触环境毒物的实际情况）人群接触环境毒物的实际情况 生产车间呼吸道生产车间呼吸道 （2 2）毒物的理化性质）毒物的理化性质 固态、液态、气态固态、液态、气态 （3 3）受检毒物的来源）受检毒物的来源 消耗量的大小消耗量的大小2.1 2.1 吸入染毒法吸入染毒法大气污染物大气污染物1 1）动式吸入染毒法动式吸入染毒法优点：优点：柜内毒物浓度相对稳定柜内毒物浓度相对稳定受试环境具有持久的稳定

11、性受试环境具有持久的稳定性 缺点：缺点：毒物消耗量大毒物消耗量大2）静式吸入染毒法）静式吸入染毒法急性急性在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封染毒柜内进行染毒柜内进行优点：优点：设备简单，操作方便设备简单，操作方便缺点：缺点：要经过一段时间才能达到实验浓度要求要经过一段时间才能达到实验浓度要求3 3）面罩染毒法）面罩染毒法优点：优点：避免皮肤吸收避免皮肤吸收注意检查面罩的密封性注意检查面罩的密封性4 4）吸入染尘法）吸入染尘法颗粒污染物颗粒污染物 5m2.2 2.2 气管注入法气管注入法经喉插入法经喉插入法气管穿刺法气管穿刺法暴露气管穿刺法暴露气管穿刺法

12、适用于颗粒物染毒。适用于颗粒物染毒。颗粒物可制备成生理盐水混悬液，也可将颗粒物中的颗粒物可制备成生理盐水混悬液，也可将颗粒物中的有害成分提取，再用提取物进行染毒。有害成分提取，再用提取物进行染毒。此法需在动物麻醉下进行，难度较大，适宜急性试验此法需在动物麻醉下进行，难度较大，适宜急性试验 2.3 2.3 经口染毒法经口染毒法不挥发性液体和固体毒物不挥发性液体和固体毒物 灌胃法灌胃法液体或制剂液体或制剂 喂饲法喂饲法混在食物中混在食物中 经口滴入经口滴入淀粉糊剂淀粉糊剂 吞咽吞咽胶囊胶囊2.4 2.4 注射染毒法注射染毒法毒物对局部损害不能太大毒物对局部损害不能太大 腹腔注射腹腔注射 肌内注射肌

13、内注射 不溶于水但溶于油或其他溶剂不溶于水但溶于油或其他溶剂 静脉注射静脉注射 皮下注射皮下注射 皮内注射皮内注射2.5 2.5 经皮染毒法经皮染毒法家兔和豚鼠家兔和豚鼠斑贴法斑贴法兔耳法兔耳法结膜囊染毒结膜囊染毒第三节第三节 毒理学实验的设计方法毒理学实验的设计方法3.1 3.1 实验设计实验设计 明确实验目的、了解毒物、预备实验明确实验目的、了解毒物、预备实验 实验类型（急性、慢性）、实验动物实验类型（急性、慢性）、实验动物 染毒方式、浓度分组、对照组（平行、自身）染毒方式、浓度分组、对照组（平行、自身）3.2 3.2 动物分组动物分组 随机化随机化第四节第四节 急性毒性实验急性毒性实验4

14、.1 4.1 急性毒性实验的内容急性毒性实验的内容 急性毒性测定急性毒性测定LD50/LC50 皮肤染毒实验皮肤染毒实验经皮肤进入经皮肤进入 局部作用实验局部作用实验有无刺激腐蚀有无刺激腐蚀 中毒症状的观察中毒症状的观察作用程度、部位作用程度、部位 功能及病理组织学检查功能及病理组织学检查部位、程度部位、程度4.2 4.2 哺乳动物的急性毒性实验哺乳动物的急性毒性实验一、半致死剂量的测定一、半致死剂量的测定（途径？）（途径？）（1 1）动物准备）动物准备(小动物、预观察小动物、预观察)（2 2）剂量选择）剂量选择（3 3）药液配置及染毒）药液配置及染毒等容量法等容量法（4 4）症状观察）症状观

15、察（5 5）病理学检查及其他指标观察）病理学检查及其他指标观察（6 6）结果评价）结果评价LDLD5050、毒性级别、毒性级别剂量的选择剂量的选择预实验测定预实验测定：最大无作用剂量、：最大无作用剂量、100死亡剂量死亡剂量按等比级数按等比级数（80%，增毒；，增毒；3080，相加；相加；30，拮抗，拮抗 实测死亡率（实测死亡率（O）/预期死亡率（预期死亡率（P）混合毒物混合毒物LDLD5050的测定方法的测定方法分别测定各毒物的分别测定各毒物的LDLD5050按按等毒性等毒性比例混合测定混合毒物的比例混合测定混合毒物的LDLD5050评定作用类型评定作用类型K0.4 拮抗；拮抗；0.4K2.

16、5 协同协同4.3 4.3 水生动物毒性实验水生动物毒性实验一、鱼类毒性实验一、鱼类毒性实验 动物选择动物选择区域代表性区域代表性 实验条件实验条件水温、溶氧、水温、溶氧、pHpH二、甲壳动物实验二、甲壳动物实验 水蚤幼虫的准备水蚤幼虫的准备 TLm TLm的测定的测定斑马鱼斑马鱼青鳉鱼青鳉鱼第五节第五节 毒物蓄积的研究方法毒物蓄积的研究方法蓄积毒性作用：蓄积毒性作用：物质蓄积：物质蓄积：环境污染物环境污染物 进入进入排出排出功能蓄积：功能蓄积：结构和功能变化的积累结构和功能变化的积累慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性5.1 5.1 物质蓄积的研究方法物质蓄积的研

17、究方法生物蓄积的极限值与其在单位生物蓄积的极限值与其在单位时间内的吸收量成正比时间内的吸收量成正比生物半衰期越短，达到极限所生物半衰期越短，达到极限所需时间就短需时间就短A=aTA=aT1/21/21.441.445.2 5.2 功能蓄积的研究方法功能蓄积的研究方法K=K=EDED50(n)50(n)EDED50(1)50(1)固定剂量连续染毒法；固定剂量连续染毒法；5LD50，蓄，蓄 积作用不明显积作用不明显剂量定期递增染毒法剂量定期递增染毒法（等比递增）（等比递增）20天蓄积实验法天蓄积实验法停药停药7天内死亡情况天内死亡情况LD50K K5,5,轻度蓄积轻度蓄积5.3 5.3 蓄积率的测

18、定方法蓄积率的测定方法蓄积率蓄积率100100预给剂量预给剂量对照组对照组LD50-预给组预给组LD50蓄积量对照组蓄积量对照组LD50预给组预给组LD50第六节第六节 亚慢性和慢性毒性实验亚慢性和慢性毒性实验必须先做蓄积实验判断可能性必须先做蓄积实验判断可能性6.1 6.1 亚慢性毒性实验亚慢性毒性实验(1/301/20)动物要求敏感、两种动物要求敏感、两种（啮齿类、非啮齿类）（啮齿类、非啮齿类）健康、年幼健康、年幼剂量剂量（高、中、低）（高、中、低）一般取一般取LD50的的1/801/50，每天，每天定时染毒，剂量相等定时染毒，剂量相等观察指标观察指标 一般指标、生化指标、病理学检查一般指

19、标、生化指标、病理学检查6.2 6.2 慢性毒性实验慢性毒性实验实验时间一般要求实验时间一般要求1 12 2年或者终生染毒年或者终生染毒一般要求选用一般要求选用几种几种动物，年龄要小动物，年龄要小设设3 34 4个剂量组和一个对照组个剂量组和一个对照组LDLD5050的的1/10001/10001/201/20之间取之间取3 34 4个剂量个剂量注意事项：注意事项：指标提前观察、同步进行、注意指标提前观察、同步进行、注意异常情况、延长饲养时间继续观察异常情况、延长饲养时间继续观察第七节第七节 致癌性实验致癌性实验7.1 7.1 长期动物实验长期动物实验实验动物的选择：实验动物的选择：抗病力强、

20、容易饲养、肿瘤抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以上动物上动物动物数目：动物数目：小型动物小型动物 50 50只；大型减少只；大型减少剂量分组与对照剂量分组与对照（阴性、阳性对照）（阴性、阳性对照）：高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）染毒途径：染毒途径：口、皮肤、注射口、皮肤、注射实验时间：实验时间：动物生命期的动物生命期的1/31/31/21/2指标观测：指标观测：外表、行为、外表、行为、X X射线、病理射线、病理 学检查学检查结果评判：结果评判：潜伏期：第一例潜伏期：第一例 病理学

21、检查：恶性、良性、癌前期变病理学检查：恶性、良性、癌前期变 阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短7.2 7.2 短期筛检方法短期筛检方法Ames实验：外源化学物致突变作用实验：外源化学物致突变作用DNA修复测定：修复测定：3H-Tdr哺乳动物细胞的体外恶性转化哺乳动物细胞的体外恶性转化AmesAmes试验试验组氨酸营养缺陷型菌株（组氨酸营养缺陷型菌株（His-）His-His+哺乳动物微粒体酶哺乳动物微粒体酶前致癌物前致癌物受试物受试物组氨酸缺乏培养基组氨酸缺乏培养基S-9混合液混合液致致突突变变物物DNA修复测定修复测定蔗糖密度梯度离心技术蔗糖密度梯度离心技术 切

22、除片段大小切除片段大小 沉降速度沉降速度放射自显影技术放射自显影技术 直接定位损伤部位直接定位损伤部位第八节第八节 致突变实验致突变实验一、哺乳动物细胞突变试验一、哺乳动物细胞突变试验正常细胞正常细胞 酶的缺失酶的缺失 突变细突变细 胞能与有害物共存胞能与有害物共存突变细胞突变细胞 不能与有害物共存不能与有害物共存回复突变回复突变正向突变正向突变正常细胞正常细胞二、染色体畸变试验二、染色体畸变试验哺乳动物体内骨髓细胞遗传学试验哺乳动物体内骨髓细胞遗传学试验人外周血淋巴细胞遗传学试验人外周血淋巴细胞遗传学试验(T、B cell)观察染色体的完整性观察染色体的完整性未分裂，未分裂，G G0 0期期

23、加秋水仙素抑制有丝分裂，使染色体加秋水仙素抑制有丝分裂，使染色体停滞在分裂中期停滞在分裂中期三、微核试验三、微核试验用于检测染色体断裂剂（诱裂剂）和纺用于检测染色体断裂剂（诱裂剂）和纺锤体毒物锤体毒物小鼠或大鼠骨髓小鼠或大鼠骨髓 高剂量高剂量每只动物计数每只动物计数1000个以上嗜多染红细胞个以上嗜多染红细胞评价：正常水平：单个动物评价：正常水平：单个动物 0.4；一组；一组动物动物 0.3四、致死试验四、致死试验（1 1）生殖细胞致突变）生殖细胞致突变小鼠或大鼠小鼠或大鼠试验分试验分5 5组，组，3 3个实验组、阴阳对照各个实验组、阴阳对照各1 1组组（2 2）果蝇伴性隐性致死试验）果蝇伴性隐性致死试验 F2观察染色体的完整性观察染色体的完整性第九节第九节 致畸性实验致畸性实验给药时间给药时间 胚胎细胞开始分化和器官形成发育阶段胚胎细胞开始分化和器官形成发育阶段检查检查产前产前1 12 2天，处死天，处死 受孕动物检查、胎仔外观检查受孕动物检查、胎仔外观检查 胎仔骨骼检查、胎仔内脏检查胎仔骨骼检查、胎仔内脏检查