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1、应用全自动基因指纹应用全自动基因指纹分析仪分析仪Riboprinter对对奶及奶制品中阪崎肠奶及奶制品中阪崎肠杆菌株的分型研究杆菌株的分型研究阪崎肠杆菌简介：阪崎肠杆菌简介：n世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎。n目前采用目前采用PCR PCR 方法进行粗筛，传方法进行粗筛，传统生化方法鉴定，检测样品包括统生化方法鉴定，检测样品包括所有奶及奶制品。所有奶及奶制品。阪崎肠杆菌分子生物学研究现状阪崎肠杆菌分子生物学研究现状n毒力因子及致病机理尚
2、属未知；nIverson等人利用16S rDNA和hsp60的基因序列对阪崎肠杆菌开展了进化学分析，认为阪崎肠杆菌在生物信息学上可分为四个簇，依据hsp60特征可进一步分为两个亚群。阪崎肠杆菌模式菌株的16SrDNA与克氏柠檬酸杆菌相似性为97.8%，与阴沟肠杆菌相似性为97.0%。nArmer等人进一步扩展了前人的研究成果，对57个菌株利用DNA杂交、抗生素敏感谱以及生化反应等进一步区分，这些特征性包括阪崎肠杆菌在25时产黄色素能力强，36时较弱，培养物置于1730不传代，最长可存活8年，仅用柠檬酸作为唯一碳源，与阴沟肠杆菌DNADNA同源性达3149，GC含量57，连续传代时产黄色素的特性
3、会丢失。n阪崎肠杆菌为我室自2003年到2006年在食品中检出的阪崎肠杆菌菌株，已经传统实验方法和Vitek生化鉴定仪确证。其中以新西兰分离获得的菌株居多数，占总数的34，这与各国进口奶粉及奶粉原料的数量直接相关，获得的菌株主要来自奶粉类固体物，少量分离自黄油、酸奶、牛奶巧克力等奶制品。n 对20052006年获得的阪崎肠杆菌菌株进行Vitek生化分型鉴定（Table 2），主要生化谱型落在6624751672；6224751672；6224751632三 种，这 三 类 谱 型 占 所 有 菌 株 的 49。其 次6624750672，6224750672谱型菌株占总数的20。由各地区分离株
4、的生化谱型来看，数量最多的新西兰分离株生化谱型也主要集中在6624751672；6224751672；6224751632三类，其他地区菌株谱型分布无统计学意义。这三类生化谱型与其他谱型的差异主要在于细菌对于Plante indican-吲哚葡萄糖苷（植物尿兰母），精氨酸及柠檬酸利用的差异。GNI革兰氏阴性细菌鉴定卡鉴定结果：革兰氏阴性细菌鉴定卡鉴定结果：阪崎肠杆菌感染性检测阪崎肠杆菌感染性检测n动物模型的建立乳鼠实验：购买Swiss Webster 1618天孕鼠，饲养至小鼠出生，小鼠长至34天与母鼠分开，四个一组，每只小鼠口服细菌滤液，给药四小时后，小鼠注射0.1ml戊巴比妥鈉实施安乐死，
5、打开腹部，肉眼检视小鼠肠道是否有膨胀或积液，每组四只小鼠肠道取出后称总重，计算肠道及余下小鼠体腔部分重量之比，比值大于0.083时视为阳性。进一步将高毒菌株进行毒素基因检测。n菌株感染性研究：所有的阪崎肠杆菌分离株按照最小感染剂量口服加腹腔注射，制备菌悬液腹腔注射乳鼠，调整细胞浓度寻找最低致死剂量，对照用0.85%生理盐水加Evans blue dye，培养基作为空白对照，所有小鼠培养观察7天。基于核糖体基于核糖体RNARNA基因基因高度保守区 非常稳定 可变位置和数目DNA 制备n溶菌液:细胞破壁n去蛋白酶:清除蛋白n消化:用限制性内切酶将 DNA 切成片段分离和转移用凝胶电泳将DNA片断按
6、大小分离开DNA片断被转移并固定在移动的尼龙膜上(直接吸附)膜处理过程膜处理过程是一系列的化学/酶反应过程导致特殊片断发出荧光检测条带的影像被数码相机扑捉数字化的影像被计算机自动存储专用软件生成 RiboPrint 图谱模式膜处理过程固定变性杂交显色结果输出n输入的图样与系统数据库输入的图样与系统数据库中已知的图谱相对比中已知的图谱相对比n 从而鉴定出样品从而鉴定出样品自动化图样分析自动化图样分析 鉴定鉴定分子分型结果分析 n将Riboprinter生成的分型图谱导入BioNumerics软件包,用UPGMA 法进行聚类分析。Pearson 相关系数为1%。将图谱相似度高于93%的菌株视为同一核糖体型,按相似度大小顺序依次命名为EcoRI-RS1、EcoRI-RS2 等。n将生成的分型图谱导入BioNumerics软件包,用UPGMA 法进行聚类分析。Pearson 相关系数为1%。将图谱相似度高于93%的菌株视为同一核糖体型,按相似度大小顺序依次命名为EcoRI-RS1、EcoRI-RS2 等。n在核糖体分型结果分析的基础上,详细处理、录入菌株的生物学背景、生态学分布及分子分型等信息,建立标准化信息库。谢谢 谢！谢！