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1、天津大学天津大学,生物化学生物化学,课件第课件第十二章十二章4-5节节-1一、一、DNADNA指导下的指导下的RNARNA合成转录合成转录1 1转录：转录：在在DNADNA指导下指导下RNARNA的合成。此过程包括的合成。此过程包括RNARNA链的起始、延伸、终止等步骤。链的起始、延伸、终止等步骤。转录要涉及两方面：转录要涉及两方面：一是一是RNARNA合成的酶学过程；合成的酶学过程；二是二是RNARNA合成的起始信号和终止信号。合成的起始信号和终止信号。模板链：模板链：转录的模板转录的模板DNADNA链，也叫反义链或负链。链，也叫反义链或负链。编码链：编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正
2、链。与模板链对应的链，也叫有义链或正链。转录的起始是由转录的起始是由DNADNA的启动子（的启动子（promterpromter）区控制区控制的，而控制终止的部位则称为终止子的，而控制终止的部位则称为终止子(ferminaforferminafor)。1 1RNARNA聚合酶与模板聚合酶与模板DNADNA结合结合3 3双链双链DNADNA局部解开局部解开2 2起始起始1 1磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成1 12 2起始起始2 2A AC CPT TPC CPGGA APP-P-POHOH53C CPGGPPPPOHOHU U磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成2 23 3延伸延伸1 1恢复的恢复
3、的DNADNA双螺旋双螺旋mRNAmRNA5延长阶段延长阶段1 1 在在DNADNA的的一一条条链链上上，通通过过碱碱基基配配对对合成合成RNARNA链，解链区沿链，解链区沿DNADNA移动移动3 3延伸延伸2 2延长阶段延长阶段2 2解链区到达基因终端解链区到达基因终端4 4终止终止1 1终止阶段终止阶段1 1RNARNA和和RNARNA聚合酶从聚合酶从DNADNA上脱落上脱落4 4终止终止2 2终止阶段终止阶段2 2：原核生物转录中止信号及产物原核生物转录中止信号及产物AGCCCGCTCGGGCGGCGGGCTCGCCCGATTTTTTTTAAAAAAAA反义链反义链有义链有义链DNAAA
4、AAAAAATTTTTTTTUUUUUUUCGGGCGGCCCGCA5反义链反义链有义链有义链DNARNA产物产物5 5原核生物的转录过程原核生物的转录过程（三）（三）RNARNA的转录后加工的转录后加工 在细胞内，由在细胞内，由RNARNA聚合酶合成的原初聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、括链的裂解、55端与端与33端的切除和特端的切除和特殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程。使其能转变为成变，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的熟的RNARNA分子，此过程总称为分子，此过程总称为R
5、NARNA的成熟的成熟或转录后加工。或转录后加工。（三）（三）RNARNA的转录后加工的转录后加工1 1原核生物原核生物RNARNA的转录后加工的转录后加工 2 2真核细胞真核细胞RNARNA的转录后加工的转录后加工 1 1原核生物原核生物RNARNA转录后加工转录后加工1 1（mRNAmRNA）原核生物的原核生物的mRNAmRNA大多不需加工，一经转大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译。录即可直接进行翻译。1 1原核生物原核生物RNARNA转录后加工转录后加工2 2（rRNA1rRNA1）大肠杆菌共有大肠杆菌共有7 7个个rRNArRNA的转录单位，它的转录单位，它们分散在基因组的各处。们
6、分散在基因组的各处。1 1原核细胞原核细胞RNARNA转录后加工转录后加工2 2（rRNA2rRNA2）P16SP16SP23SP23SP5SP5S16S16S23S23S5S5S细菌细菌rRNArRNA的形成的形成1 1原核生物原核生物RNARNA转录后加工转录后加工3 3（tRNA1tRNA1）大肠杆菌染色体基因组共有大肠杆菌染色体基因组共有tRNAtRNA基基因约因约6060个，这个数字远大于按变偶假说个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码所要求的反密码子数。即：某些反密码子可能不只一个子可能不只一个tRNAtRNA分子，或某些分子，或某些tRNAtRNA基因不是
7、一个拷贝。基因不是一个拷贝。tRNAtRNA基因大多成簇基因大多成簇存在。存在。tRNAtRNA转录时首先成为转录时首先成为tRNAtRNA前体。前体。1 1原核生物原核生物RNARNA转录后加工转录后加工3 3（tRNA2tRNA2）5ppp转录转录tRNAtRNA前体前体tRNAtRNAOH35pppOH3OH3+核苷核苷酸降解产物酸降解产物降解至单降解至单核苷酸核苷酸p成熟的成熟的tRNAtRNAUGm2GAi6A等等修饰修饰tRNAtRNA的形成的形成2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工1 1（rRNA1rRNA1）RNA聚合聚合酶的种类酶的种类功能功能所在所在I I
8、rRNArRNA的前体的前体核仁核仁IIIImRNAmRNA的前体的前体核质核质IIIIII5SrRNA5SrRNA、tRNAtRNA、及其他多种、及其他多种小分子核仁和核浆小分子核仁和核浆RNARNA前体前体核质核质2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工2 2（rRNA2rRNA2）18S18S5.8S5.8S28S28S45S45S甲基化作用甲基化作用核酸内切酶核酸内切酶18S18SRNARNA5.8S5.8SRNARNA28S28SRNARNA真核生物真核生物rRNArRNA前体的加工前体的加工2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工3 3（rRNA3rRN
9、A3）真核生物真核生物rRNArRNA的生成与成熟的生成与成熟45S 45S 5S5S41S41S32S32S 5S 20S 5S 20S32S 32S 5S5S细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质28S 28S 5.8S5.8S18S 18S 5S 5S 28S 28S 5.8S5.8S18S 18S 核蛋白体核蛋白体2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工4 4（tRNA1tRNA1）在在酶酶的的催催化化下下，切切掉掉部部分分核核苷苷酸酸分分子子（包包括括1414分分子子的的UMPUMP、7 7分分子子CMPCMP、8 8分分子子GMPGMP及及少少于于1 1分子的分子的AMPA
10、MP）。）。tRNAtRNA前前体体分分子子被被修修饰饰：其其一一是是有有些些尿尿嘧嘧啶啶残残基基转转变变为为拟拟尿尿嘧嘧啶啶或或二二氢氢尿尿嘧嘧啶啶残残基基；其其二二是是甲甲基基化化作作用用。此此变变化化是是在在甲甲基基转转移移酶酶的的催催化化下下，由由s-s-腺腺苷苷蛋蛋氨氨酸酸供供给给甲甲基基，在在多多核核苷苷酸酸水水平上进行。平上进行。从从tRNAtRNA前体转变到前体转变到tRNAtRNA的过程的过程2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工5 5（tRNA2tRNA2）tRNAtRNA的生成的生成细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质tRNAtRNA基因基因转录转录5切断切断
11、tRNAtRNA前体前体nCH3拟尿苷生成拟尿苷生成tRNAtRNA2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工6 6（mRNA1mRNA1）两者都为不均一分子两者都为不均一分子两者碱基组成上有部分相似两者碱基组成上有部分相似两两者者33末末端端都都有有多多聚聚腺腺苷苷酸酸尾尾部部；55端端连接有连接有GMTPGMTP（7-7-甲基鸟苷）的帽子甲基鸟苷）的帽子（1 1）细胞核中的不均一核）细胞核中的不均一核RNARNA（HnRNAHnRNA）可能是可能是mRNAmRNA的前体的前体,因为：因为：2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工7 7（mRNA2mRNA2）55端
12、端 形形 成成 特特 殊殊 的的 帽帽 子子 结结 构构（M M7 7G G55PPPPPP55NmpNp-NmpNp-）在在链链的的33端端切切断断并并加加上上多多聚聚腺腺苷酸（苷酸（polyApolyA）尾巴）尾巴通通过过拼拼接接除除去去由由内内含含子子转转录录来来的序列的序列链内部核苷被甲基化链内部核苷被甲基化（2 2）HnRNAHnRNA转变成转变成mRNAmRNA的加工过程：的加工过程：2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工8 8（mRNA3mRNA3）卵清蛋白基因产生卵清蛋白基因产生mRNAmRNA的过程：的过程：转录转录1 2 3 4 5 6 7 A B C D
13、E F G 卵清蛋白基因卵清蛋白基因(7700(7700个核苷酸个核苷酸)1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G LL5533加帽子和尾巴加帽子和尾巴1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G L5533内含子内含子RNA的除去的除去 和拼接作用和拼接作用12345 6 7 LCAPCAPPolyAPolyA尾尾成熟的成熟的mRNAmRNA18721872个核苷酸个核苷酸2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工9 9（mRNA4mRNA4）2 2真核生物真核生物RNARNA转录后加工转录后加工1010（帽子结构形成过程）（帽子结构形成过程）GTPPip
14、ppN1N2N3G5 ppp5 N1N2N3 pppN1N2N3 RNARNA三磷酸酶三磷酸酶PiimRNAmRNA鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸m7G5 ppp5 N1N2N3 S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸mRNA(mRNA(鸟嘌呤鸟嘌呤-7-)-7-)甲基转移酶甲基转移酶mRNA(mRNA(核苷核苷-2-2-)甲基转移酶甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m7G5 ppp5 N1 mN2N3 S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m7G5 ppp5 N1 mN2mN3 mRNA(mRNA(核苷核苷-2-2-)
15、甲基转移酶甲基转移酶二、二、RNARNA指导下的指导下的RNARNA合成合成RNARNA复制复制病毒正链（具病毒正链（具mRNAmRNA功能）功能）pppG5 3 OH5 5 pp3 OH复制中间体复制中间体5 3 3 新合成的负链新合成的负链病毒正链为模板病毒正链为模板复制酶复制酶5 三、依靠反转录的三、依靠反转录的DNADNA生物合成生物合成1 1 19701970年年TeminTemin和和BaltimoreBaltimore同同时时分分别别从从致致癌癌RNARNA病病毒毒中中发发现现RNARNA指指导导的的DNADNA聚聚合合酶酶。由由于于它它催催化化遗遗传传信信息息从从RNARNA流
16、流向向DNADNA，与与转转录录作作用用正正好好相相反反，故称为反转录酶或逆转录酶。故称为反转录酶或逆转录酶。病病毒毒感感染染细细胞胞后后，通通过过逆逆转转录录酶酶生生成成与与病病毒毒RNARNA碱碱基基序序列列互互补补的的DNADNA，并并整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体DNADNA中中。此此后后，在在宿宿主主细细胞胞内内，这这段段插插入入的的DNADNA经经转转录录生生成成相相应应的的mRNAmRNA，再再转转译译成成病病毒专一的蛋白质。毒专一的蛋白质。三、依靠反转录的三、依靠反转录的DNADNA生物合成生物合成2 2 RNA3 5 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶RN
17、A3 5 核糖核酸酶核糖核酸酶H53 53 cDNA依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶cDNA杂种分子杂种分子35 53 双链双链DNA新合成的双链新合成的双链DNA整合到整合到寄主染色体寄主染色体DNA中中第五节第五节 基因的重组与基因的重组与DNA“DNA“克隆克隆”DNADNA重组技术是指将不同的重组技术是指将不同的DNADNA片段按人们的片段按人们的设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。胞获得新的遗传特性。从某种意义上来说，从某种意义上来说，D
18、NADNA重组技术也可理解重组技术也可理解为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的技术。技术。第五节第五节 基因的重组与基因的重组与DNA“DNA“克隆克隆”2”2一、一、DNADNA重组技术的用途重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体二、重组中所用的酶和载体三、重组的大致步骤三、重组的大致步骤一、一、DNADNA重组技术的用途重组技术的用途1 1利用利用DNADNA重组技术大量生产一些在正常组重组技术大量生产一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。多肽抗生素、酶类、
19、抗体及各种肽类。2 2定向地改造生物基因组结构，使其具有定向地改造生物基因组结构，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。3 3将将DNADNA重组技术应用于基础研究。如在基重组技术应用于基础研究。如在基因组结构及基因组功能调节的研究。因组结构及基因组功能调节的研究。二、重组中的酶及载体二、重组中的酶及载体（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶 （二）载体（二）载体（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶1 1 1 1限制性内切酶限制性内切酶2 2T T4 4DNADNA连接酶连接酶3 3大肠杆菌大肠杆菌
20、 DNA DNA聚合酶聚合酶I I4 4大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶大片段（聚合酶大片段（klenowklenow片段）片段）5 5T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶6 6T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶7 7反转录酶反转录酶8 8细菌碱性磷酯酶细菌碱性磷酯酶9 9核酸酶核酸酶S S1 11010脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶I I1111polyApolyA聚合酶聚合酶（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 由由同同一一个个限限制制性性内内切切酶酶切切断断得得到到的的任任何何两两个个DNADNA片片段段的的粘粘性性末末端端都都可可以以互互相相配配对对，然
21、然后后每每条条DNADNA链链的的断断开开部部分分再再通通过过DNADNA连连接接酶酶所所产产生生的磷酸二酯键连接起来。的磷酸二酯键连接起来。1.1.限制性内切酶限制性内切酶1 1（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 1.1.限制性内切酶限制性内切酶2 2 酶酶（产生平头末端）（产生平头末端）限制和修饰部位限制和修饰部位来源来源 HindII5-G-T-Py-Pu-A-C-3 3-C-A-Pu-Py-T-G-5流感嗜血菌流感嗜血菌 HindI 5-G-T-T-A-A-C-3 3-C-A-A-T-T-G-5副流感副流感嗜血菌嗜血菌*（一）（一）DNADNA体外重组中
22、常用的酶体外重组中常用的酶2 2 酶酶（产生粘性末端）（产生粘性末端）限制和修饰部位限制和修饰部位来源来源 EcoRI 5-G-A-A-T-T-C-3 3-C-T-T-A-A-G-5流感嗜血菌流感嗜血菌EcoRII 5-N-C-C-N-G-G-N-3 3-N-G-G-N-C-C-N-5大肠杆菌大肠杆菌EcoRIII 5-A-A-G-C-T-T-3 3-T-T-C-G-A-A-5流感嗜血菌流感嗜血菌*（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶2 2 1.1.限制性内切酶限制性内切酶3 3（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶3 3 2 2T T4 4DNA
23、DNA连连接接酶酶：是是从从噬噬菌菌体体T T4 4 感感染染过过的的大大肠肠杆杆菌菌中中分分离离出出来来的的。此此酶酶由由一一条条肽肽链链组组成成，分分子子量量68006800，催催化化DNADNA上上的的3-OH3-OH与与5-P5-P末末端端之之间间的的磷磷酸酸二二酯酯键键的的形形成成，既既可可催催化化粘粘性性末末端端又又可可催催化化平头末端间的连接。催化过程需平头末端间的连接。催化过程需ATPATP和和MgMg2+2+3 3大肠杆菌大肠杆菌 DNA DNA聚合酶聚合酶I I：5-35-3聚合酶活力聚合酶活力4 4大大肠肠杆杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶大大片片段段（klenowklen
24、ow片片段段）：将将大大肠肠杆杆菌菌DNADNA聚聚合合酶酶用用枯枯草草杆杆菌菌素素来来降降解解，形形成成的的产产物物中中有有一一个个分分子子量量为为76,00076,000的的多多肽肽，即即为为此此酶酶。它它失失去去了了5-35-3外外切切酶酶活活力力，其其它它功功能能与与DNADNA聚合酶相同，此酶用途很广。聚合酶相同，此酶用途很广。（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶4 4 5 5T T4 4DNADNA聚聚合合酶酶：它它存存在在于于噬噬菌菌体体T T4 4中中，与与klenowklenow片片段段相相似似，5-35-3聚聚合合酶酶活活力力比比大大肠肠杆杆菌菌DN
25、ADNA酶多酶多200200倍。倍。6 6T T4 4多多核核苷苷酸酸激激酶酶：此此酶酶是是从从T T4 4感感染染过过的的大大肠肠杆杆菌菌中中分分离离出出来来的的，它它催催化化ATPATP上上的的-P-P转转移移到到DNADNA或或RNARNA的的5-OH5-OH上上，所所以以可可用用来来标标记记DNADNA或或RNARNA。7 7反反转转录录酶酶：合合成成cDNAcDNA的的第第一一条条链链，具具有有5-3DNA5-3DNA聚合酶活力。聚合酶活力。（一）（一）DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶5 5 8 8细细菌菌碱碱性性磷磷酯酯酶酶：十十分分耐耐热热，可可将将DNADNA或
26、或RNARNA的的5-P5-P除除去去，反反应应常常在在60600 0C C以以上上进进行行，以以抑制反应中其他内切酶。抑制反应中其他内切酶。9 9核核酸酸酶酶S S1 1：催催化化单单链链DNADNA降降解解，产产生生5-5-P P结结尾尾的的单单核核苷苷酸酸或或寡寡核核苷苷酸酸，用用以以切切除除双双链链cDNAcDNA上的发夹形结构上的单链凸环。上的发夹形结构上的单链凸环。1010脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶I I：是是一一种种内内切切酶酶，降降解解双双链链或或单单链链DNADNA，产产生生以以5-P5-P结结尾尾的的单单核核苷酸及寡核苷酸的混合物。苷酸及寡核苷酸的混合物。1111poly
27、ApolyA聚合酶：聚合酶：催化将催化将AMPAMP加到加到RNARNA的的3-OH3-OH末端，形成末端，形成3-polyA3-polyA的反应。的反应。（二）载体（二）载体（总）（总）1 1定义定义2 2载体必须具备的条件载体必须具备的条件 3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1定义定义 外外源源DNADNA片片段段要要进进入入受受体体细细胞胞，并并在在其其中中进进行行复复制制与与表表达达，必必须须有有一一个个适适当当的的运运载载工工具具将将其其带带入入细细胞胞内内，并并载载着着外外源源DNADNA一一起起进进行行复复制制与与表表达达，这这种运载工具称为载体种运载工具称为载体 。2 2载
28、体必须具备如下条件载体必须具备如下条件 （1 1）在在受受体体细细胞胞中中，可可以以独独立立进进行行复复制制，所所以以其其本本身身必必须须是是一一个个复复制制单单位位，而而且且插插入入外外源源DNADNA后后不不会会影影响响其其本本身身的的复制能力。复制能力。（2 2）易易于于鉴鉴定定、筛筛选选。即即易易将将带带有有外外源源DNADNA的重组体与正常的载体区别开。的重组体与正常的载体区别开。（3 3）易于引入受体细胞。）易于引入受体细胞。3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1（总）（总）（1 1）质质粒粒：是是比比较较小小的的双双链链DNADNA环环形形分分子，在细菌和酵母中都存在。子，在细
29、菌和酵母中都存在。（2 2）噬噬菌菌体体：包包括括噬噬菌菌体体、装装配配型型质质粒粒（噬噬菌菌体体改改造造）及及 M13M13噬噬菌菌体体（是一种含有单链（是一种含有单链DNADNA的噬菌体）。的噬菌体）。3 3目前常用的载体目前常用的载体1 1（总）（总）3 3目前常用的载体目前常用的载体2 2（噬菌体为载体）噬菌体为载体）DNADNA用限制酶除用限制酶除去中间一段去中间一段太小不能太小不能被包装被包装与外源与外源DNADNA连接连接重组重组DNADNA分子的体外包装分子的体外包装带有外源带有外源DNADNA的的噬菌体噬菌体三、重组的步骤三、重组的步骤1 1（1 1）外源）外源DNADNA与
30、载体的连接，形成重组与载体的连接，形成重组DNADNA（2 2）通过转化（或感染）将重组）通过转化（或感染）将重组DNADNA引入引入受体细胞受体细胞（3 3）筛选出含有重组体的阳性克隆）筛选出含有重组体的阳性克隆 三、重组的步骤三、重组的步骤1 1DNA与载体相连接与载体相连接简明简明P235P235图图12121313、12121414载体载体外源基因外源基因三、重组的步骤三、重组的步骤2 2转化与筛选转化与筛选含有不同插入含有不同插入DNADNA片断的质粒片断的质粒细菌细胞细菌细胞转化并置于有抗生素的介质转化并置于有抗生素的介质带有抗药性质粒带有抗药性质粒的细菌才生长的细菌才生长鉴定携有
31、鉴定携有DNADNA片断克隆的片断克隆的的菌落，并扩大培养的菌落，并扩大培养质粒质粒DNADNA纯化纯化三、三、DNADNA表达的一般步骤表达的一般步骤1 1 1 1目的基因的取得目的基因的取得2 2 外外 源源 DNADNA与与 载载 体体 的的 连连 接接，形形 成成 重组重组DNADNA3 3将重组将重组DNADNA引入受体细胞引入受体细胞4 4重组体的筛选重组体的筛选5 5表达表达 三、三、DNADNA表达的一般步骤表达的一般步骤2 2 待插入的待插入的外源外源DNADNA质粒载体质粒载体连接连接重组体重组体DNADNA经转化作用或病毒经转化作用或病毒感染引入宿主细胞感染引入宿主细胞宿
32、主染宿主染色体色体筛选出具有重组体筛选出具有重组体DNADNA的细胞的细胞克隆克隆DNADNA重组体的构建和克隆重组体的构建和克隆1 1目的基因的取得目的基因的取得分离法、合成法分离法、合成法 （1 1）DNADNA片段的直接提取片段的直接提取（2 2）用噬菌体或质粒从宿主细胞）用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出中将目的基因携出（3 3）使用相应的）使用相应的mRNAmRNA分离基因分离基因2 2外源外源DNADNA与载体连接形成重组与载体连接形成重组DNA1DNA1（1 1）粘性末端连接）粘性末端连接（2 2）平头末端连接）平头末端连接（3 3）在在DNADNA片片断断末末端端加加上上
33、均均聚聚寡寡核核苷苷酸酸后后连连接接，在在3-OH3-OH端端由由末末端端核核苷苷酸酸转转移移酶酶添添加加单核苷酸的反应单核苷酸的反应（4 4）用用接接头头连连接接：适适用用于于粘粘端端与与平平端端DNADNA之间的连接之间的连接外源外源DNADNA与载体的与载体的DNADNA之间的连接方式：之间的连接方式：2 2外源外源DNADNA与载体连接形成重组与载体连接形成重组DNA2DNA2（1 1）粘性末端连接）粘性末端连接TGCATGCAACGTGCATE.coliE.coli质粒质粒限制酶限制酶TGCAACGTTGCAACGT限制酶限制酶ACGTGCATGCAT混合、退火混合、退火 DNA D
34、NA连接酶连接连接酶连接重组体重组体DNADNATGCATGCATGCATGCA2 2外源外源DNADNA与载体连接形成重组与载体连接形成重组DNA3DNA3（2 2）平头末端连接）平头末端连接 T4DNA T4DNA连接酶连接酶（DNADNA浓度低）浓度低）T4DNA T4DNA连接酶连接酶（DNADNA浓度很高）浓度很高）T4DNA T4DNA连接酶连接酶（DNADNA浓度低）浓度低）2 2外源外源DNADNA与载体连接形成重组与载体连接形成重组DNA4DNA4（3 3）互补均聚寡核苷酸末端间的连接）互补均聚寡核苷酸末端间的连接5 外切酶外切酶3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 3
35、 末端核苷酸转移酶末端核苷酸转移酶AAAAAAAATTTTTTTT+dATP+dTTPDNA po1I/DNA连接酶连接酶2 2外源外源DNADNA与载体连接形成重组与载体连接形成重组DNA5DNA5（4 4）用接头连接）用接头连接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG载体载体待插入的待插入的DNA合成的接头合成的接头（10聚体）聚体）T4DNA T4DNA连接酶连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIG AATTCCTTAA GAATTCGGCTTAA退火、连接退火、连接GAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAG重组体重组
36、体DNA3 3将重组将重组DNADNA引入受体细胞引入受体细胞通过转化、转导、转染等方式通过转化、转导、转染等方式（1 1）化学法、氯化钙法等）化学法、氯化钙法等（2 2）电击法）电击法（3 3）显微注射法）显微注射法4 4重组体的筛选重组体的筛选1 1（1 1）插入失活）插入失活（2 2）菌落原位杂交）菌落原位杂交（3 3）免疫学方法）免疫学方法（4 4）R-R-环检测法环检测法4 4重组体的筛选重组体的筛选2 2 插入失活插入失活4 4重组体的筛选重组体的筛选3 3原位杂交法筛选原位杂交法筛选DNADNA重组体重组体细菌菌落细菌菌落复印至硝酸复印至硝酸纤维薄膜上纤维薄膜上用用NaOH使使菌
37、体裂解，菌体裂解，DNA变性变性单链单链DNA结结合到膜上合到膜上32P-cDNA杂交杂交放射性自显影放射性自显影与放射性与放射性cDNA杂交的杂交的菌落斑点菌落斑点5 5表达表达外外源源基基因因在在受受体体细细胞胞（真真核核基基因因在在原原核核细细胞）中表达必须满足下列条件：胞）中表达必须满足下列条件：（1 1）启启动动子子能能否否被被原原核核细细胞胞RNARNA聚聚合合酶酶识识别和转录。别和转录。（2 2）转转录录出出的的mRNAmRNA是是否否有有核核糖糖体体结结合合位位点而顺利进行翻译。点而顺利进行翻译。（3 3）翻翻译译产产物物能能否否通通过过细细胞胞膜膜而而排排出出体体外。外。（4 4）外外源源蛋蛋白白是是否否被被受受体体细细胞胞的的蛋蛋白白酶酶降解。降解。