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1、touhun本科学生试验报告学号104120440姓 名孙 永 升学院 生命科学学院专业、班级 10 生物技术试验课程名称酶 工 程 教师及职称李 俊 俊开课学期 2023至2023学年其次学期填报时间2023年5月29日云南师范大学教务处编印6试验名称试验方式小组成员XX XX试验六 纤维素酶的固定化及其性质测定小组合作XXXX1、试验目的1.1 了解酶制剂的固定化方法；1.2 学会固定化酶酶学特性的测定方法。2、试验仪器、试剂和溶液：2.1 仪器：紫外分光光度计、比色皿3个、恒温水浴锅、试管架1个、l移液管、洗耳球、注射器、标签假设干等。2 .2 试剂和溶液2.2.1柠檬酸钙缓冲液，0.0
2、5mol/L，pH4.8;2.2.210mg/ml的CMC-Na溶液底物溶液;2.2.3DNS试剂CMCA-DNS;2.2.4稀释到200倍的纤维素酶液;2.2.52.5%、3.5%、4.5%、 5.5%的海藻酸钙溶液;2.2.62%的CaCl 溶液。23、试验原理或装置示意图：3.1 酶的固定化把游离的水溶性酶限制在某一局部空间或固体载体上，酶固定后既不会流失，也不会污染产品，而且稳定性得到提高可长期反复使用。3.2 最常用的固定化方法是包埋法。3.3 海藻酸钙包埋法：通常是在其钙盐溶液中参加二价离子如Ca2+，通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络。4、试验方法步骤、操作流程及留意事项：4
3、.1 试验方法：一酶液的预备二纤维素酶的固定化三固定化纤维素酶性质的测定4 .2 试验操作步骤：1、将预先预备好的200倍纤维素酶液酶准确稀释：固定化酶稀释到1000倍，测游离酶稀释到10000倍待用。2、纤维素酶的固定化：各取四瓶200mlCaCl 溶液于500ml三角瓶中待用。各取30ml不同2浓度2.5%、3.5%、4.5%、5.5%的海藻酸钙于50ml小烧杯中，并分别取取稀释到1000倍的纤维素酶液10ml参加不同浓度的海藻酸钙溶液中，混合均匀。3、用注射器将上述混合液取20ml各取四次渐渐滴入200mlCaCl 溶液的三角瓶中2静止冷却20min后,经固定化的小球纱布过滤晾干待用。4
4、、准确称取各个浓度制成的海藻酸钙纤维素酶0.5g固定化小球，游离酶量取0.5ml，60预热10min。5、准确计时后，于保温后的酶液中依次加如CMC-Na溶液2.00mL振荡混匀，在50水浴中连续保温30min准确计时。固定化酶比照中不参加底物、游离酶比照中先不参加酶液6、反响混合物物保温 30min 后，于各个浓度底物试管中参加 3mLDNS 试剂终止液，快速振荡均匀。（1） 于游离酶比照中参加 0.5 ml 的酶液。（2） 于固定化酶比照中参加 2.00mLCMC-Na 溶液。7、混合后将各个试验组的三支试管沸水浴 5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在 540nm 处读取
5、 OD 值。8、固定化酶与游离酶稳定性比较操作按上面所述：将得到的固定化纤维素酶海藻酸钙浓度为 3.5%与等量的游离纤维素酶分别在 60下保温 10min、20min、30min、40min、50min，保温后按标准方法进展酶活测定分别做三个平行。9、海藻酸钙浓度对酶活性的影响：分别用2.5%、3.5%、4.5%和 5.5%的海藻酸钙浓度来固定化酶，并分别测定固定化酶的活性分别做三个平行。4.3 试验留意事项本试验耗时长在测定中尽量削减操作错误：应熟知流程、步骤。另：试验所测定内容较多，因此应小组分工合作协作完成。留意以下事项：酶液准确稀释。移液管使用时量取精准，保证结果牢靠准确。试管上编号：
6、贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；在纤维素酶固定化测定中是底物参加酶液：空白比照先不加底物，游离酶测定中空白比照先不加酶液。准确记时：每一管参加酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避开试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5、试验结果与数据处理：5.1 试验数据与结果：表一固定化酶3.5%与游离酶稳定性的比较吸光度 OD酶活 u/g、相对酶活(%)540、保温时间min固定化纤维素酶酶游离纤维素酶酶100.0375639.0433.630.05857586.5065.23200.25901900.61100.000.06958213.0170.62300.1965154
7、4.6481.270.08058839.5376.00400.13731207.4663.530.129511630.36100.00500.0570653.4634.380.07556008.0051.66注：固定化酶所用源酶液稀释 1000，相对酶活以 1900.61 u/g 为 100%计算；游离酶 10000 倍， 相对酶活以 11630.36u/g 为 100%计算.表二不同海藻酸钙浓度的固定化酶的活性海藻酸钙浓度%吸光度OD固定化纤维素酶活u/g 相对酶活%5402.50.0295593.4863.853.50.0885929.52100.004.50.0390741.1579.7
8、35.50.0297601.5964.72注：相对酶活以本组测定酶活最高 929.52 u/g 为 100%计算.5.2 结果处理经统计软件作图分析结果如下：5.2.1 固定化酶3.5%与游离酶酶活稳定性的比较如图一、二、三：图一图二 3.5%海藻酸钠的固定化纤维素酶与游离纤维素酶相对活性% 120 活 酶100对 相 80604020固定化纤维素相对酶活游离纤维素相对酶活0反响时间min0204060图三5.2.2 不同海藻酸钙浓度固定化酶的纤维素酶相对活性如图四：不同浓度的海藻酸钙对固定化纤维素酶相对活性影响1201003.5804.5602.56.54020002468%性活酶对相海藻酸
9、钠浓度%图四结果：酶活(相对酶活)比较：固定化酶3.5%与游离酶酶活稳定性由图一、二、三可以看出：海藻酸钙3.5%所制成的纤维素固定化酶相对活性随反响时间的增加在 20min 时到达最大 100%，后渐渐减小。曲线在 30min 时与游离纤维素酶曲线有一个交点：时间增加固定化酶活性降低，40min 时， 纤维素游离酶活性达最大相对活性：100%，之后减低，酶相对活性远远高于固定化酶相对活性。酶稳定性比较：由图三可看出在反响 30min 以后，游离酶的酶活稳定性保持上升 到40min 达最大酶活，之后酶活相对活性急剧下降曲线斜率较陡曲；而固定化纤维素酶的酶活从20min 后保持平缓的下降趋势斜率
10、较缓，即稳定性较高。不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%上升，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在 3.5% 达最大相对酶活性 100%。6、 分析与争辩：酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于肯定区域内,仍能进展其特有的催化反响、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温存的酶催化反响特性的同时,又抑制了游离酶的缺乏之处,呈现贮存稳定性高、分别回收简洁、可屡次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。优点在于酶不参与化
11、学反响,整体构造保持不变,酶的催化活性得到很好保存。试验中所承受的时物理包埋法，承受海藻酸钙介质包埋纤维素酶制成固定化纤维素酶。一纤维素固定化酶与游离酶活性比较初步得出结论：3.5%海藻酸钙固定所制得的酶到最大反响时其反响时间20min明显短于游离酶的反响时间(40min);反映出固定化酶的优势之一。二在探究不同海藻酸钙浓度对固定化纤维素酶活性影响中，可以看到随浓度的增加酶相对活性先增后减在 3.5%时最大。由此我们初步确定海藻酸钙固定纤维素酶的最适浓度。三有试验觉察经固定化后纤维素酶的活性降低，但固定化酶的增加稳定性温度 60， 不同时间与游离酶相比较增加。对于固定化酶活性受各种因素所影响：
12、海藻酸钙的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。因此为确定固定化纤维素酶所用海藻酸钙准确浓度需进一步试验承受单因子变量。由图四可知, 在海藻酸钙浓度质量分数为 3.5% 时,固定化酶活力最大。当海藻酸钙质量分数过大时,其黏度很大, 难以挤成球状, 影响凝胶成型, 同时凝胶的孔径也小, 影响酶与底物的结合。反之海藻酸钙质量分数太小, 凝胶的孔径较大, 固定化酶简洁流失, 也会影响酶活。因此, 适宜质量分数的海藻酸钙易形成机械强度适宜的凝胶, 同时底物和产物易于从凝胶微孔集中通过, 酶促反响速度较快, 所以选择海藻酸钙浓度质量分数3.5% 为宜。对酶固定化后酶稳定性提高的缘由可能有以下几
13、点： 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶伸展变形； 酶活力的缓慢释放； 抑制酶的自降解，将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的时机，从而抑制了降解。7、试验小结：把握海藻酸钙固定纤维素酶的根本原理与操作方法纤维。在海藻酸钙固定纤维素酶中由于固定化效果受各种条件影响：海藻酸钙的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。因此试验中严格把握除海藻酸钙钙外的因素。做到准确，削减试验操作误差，增加结果可信度。8、试验思考题： 为什么海藻酸钙浓度的固定化酶的活性产生影响？答：固定化条件对固定化酶活力的影响主要有：海藻酸钙的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。海藻酸钙具有猛
14、烈的吸附作用，可与 Ca2+、Cu2+等正二价阳离子快速形成凝胶，海藻酸钙浓度过大凝胶的空径越小，影响酶与底物结合；海藻酸钙浓度太小，凝胶的孔径较大，固定化简洁流失，所以酶活较低。所以海藻酸钙浓度有一个最正确浓度值。为什么海藻酸钠浓度的固定化酶的活性产生影响？答：固定化条件对固定化酶活力的影响主要有：海藻酸钠的浓度、氯化钙的浓度、纤维素酶用量、固定化时间等。海藻酸钠具有猛烈的吸附作用，可与Ca2+、Cu2+等正二价阳离子快速形成凝胶，海藻酸钠浓度过大凝胶的空径越小，影响酶与底物结合；海藻酸钠浓度太小， 凝胶的孔径较大，固定化简洁流失，所以酶活较低。所以海藻酸钠浓度有一个最正确浓度值。9、参考文
15、献：1 鲁玉侠, 蔡妙颜, 郭祀远, 王兆梅. 海藻酸钙包埋法制备固定化脂肪酶争辩J. 现代食品科技, 2023,4(22):3032.2 潘利华, 罗建平, 查学强等. 海藻酸钠固定化 -葡萄糖苷酶的制备及其性质争辩 J. 合肥工业大学学报( 自然科学版)，2023,10(30): 13321335.3 张 琛，张宽朝，章 琛，缪 伟. 海藻酸钙包埋法制备固定化菠萝蛋白酶 J. 生物加工程,2023, 6(7):3134.4 王华，王莹，李爱娟等 . 海藻酸钙交联包埋法固定化纤维素酶争辩 J. 江苏农业科学,2023,3(41) :325327.指导教师评语及得分：签名：2023 年 06 月日