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1、常用免疫学相关实验技术及方法常用免疫学相关实验技术及方法第一节第一节 免疫学方法概论免疫学方法概论一、免疫学方法的一、免疫学方法的发展史展史1976年：年：Jenner发明了接种牛痘方法明了接种牛痘方法预防天花防天花 2个世个世纪后被广泛接受，后被广泛接受，1979年（年（WHO）天花）天花灭迹。迹。19世世纪末期：末期：koch病原体是感染性疾病病因病原体是感染性疾病病因 促促进了了实验免疫学的免疫学的发展。展。19世世纪80年代：年代：Pasteur预防防鸡霍乱的疫苗霍乱的疫苗 狂犬病疫苗狂犬病疫苗1888：Behring发现了抗体了抗体 Methchnikoff发现了巨噬了巨噬细胞胞20
2、世世纪初：初：发现了了调理素，体液因素可影响吞噬理素，体液因素可影响吞噬细胞功能胞功能1900-1930：认识了了过敏反敏反应，发现了血清病了血清病 Arthus反反应，皮肤反，皮肤反应 调理作用，理作用，补体体结合反合反应 疫苗研究有了新疫苗研究有了新发展：展：BCG结核核 白喉毒素白喉毒素白喉白喉1935-1957：抗体：抗体纯化，化，鉴定及定及测定技定技术、凝胶内沉淀技凝胶内沉淀技术，抗原抗体、，抗原抗体、免疫免疫电泳等血清血技泳等血清血技术1959-1974：放射：放射标记免疫技免疫技术、酶标免疫技免疫技术、生物素生物素-亲和素和素标记免疫技免疫技术、荧光光标记免疫技免疫技术、金、金(
3、银)标记免疫等技免疫等技术；化学化学发光免疫技光免疫技术、免疫分子、免疫分子转染技染技术、细胞和胞和细胞因子胞因子测定技定技术20世世纪70年代后期：免疫及分子生物学技年代后期：免疫及分子生物学技术发展成熟，展成熟，单克隆抗体克隆抗体问世，世，组织相容性抗原、相容性抗原、B细胞免疫球蛋白基因重胞免疫球蛋白基因重组，T细胞受体胞受体1980：PCR技技术 生物芯片技生物芯片技术 转基因基因动物技物技术免疫学方法就是通免疫学方法就是通过实验证实机体免疫反机体免疫反应的的过程。程。基本参与基本参与单位有：抗原位有：抗原 抗体抗体 免疫免疫细胞和免疫分子胞和免疫分子第二节第二节 体液免疫学方法体液免疫
4、学方法一、抗原制一、抗原制备1.天然抗原制天然抗原制备(1)粗抗原的提取：粗抗原的提取：冻融法、冷融法、冷热交替法、超声法交替法、超声法(1-2HE)(2)粗抗原粗抗原纯化：化：w选择性沉淀法：性沉淀法：盐析沉淀法、核酸沉淀法析沉淀法、核酸沉淀法w凝胶凝胶过滤和离子交和离子交换层析析w亲和和层析法析法w蛋白蛋白电泳泳2.合成抗原制合成抗原制备化学合成高分子氨基酸聚合物，即多化学合成高分子氨基酸聚合物，即多肽。合成合成肽与与载体蛋白体蛋白连接后能有效接后能有效诱导抗体抗体产生免疫生免疫应答答常用方法：常用方法：tea bag method纯化方法：反向高效液相色化方法：反向高效液相色谱法法二、抗
5、体制二、抗体制备1.多克隆抗体制多克隆抗体制备(polyclonal antibody)多多克克隆隆抗抗体体是是指指在在自自然然免免疫疫或或免免疫疫动物物后后产生生的的具具有有不不同同特特异异性性和和亲和和性性的的多多种种抗抗体体混混合合分分子子。具具有有抗抗多多种不同抗原的表位。种不同抗原的表位。2.单克隆抗体制克隆抗体制备(monoclonal antibody)单克克隆隆抗抗体体是是指指由由一一个个识别一一种种抗抗原原表表位位的的B细胞胞克隆克隆产生的同源抗体。生的同源抗体。产生生方方法法：B细胞胞克克隆隆与与小小鼠鼠骨骨髓髓瘤瘤细胞胞融融合合产生生的的杂交瘤交瘤细胞胞3.基因工程抗体基
6、因工程抗体(engineer antibody)应用抗体用抗体库技技术产生生方方法法：将将某某种种动物物所所有有抗抗体体的的可可变区区基基因因克克隆隆到到质粒粒或或噬噬菌菌体体中中并并表表达达，然然后后利利用用不不同同抗抗原原筛选出出携携带特特异异抗抗体的基因克隆，从而体的基因克隆，从而获得特异性抗体。得特异性抗体。三、抗体的三、抗体的应用及其相用及其相应的免疫学技的免疫学技术(一一)ELISA ELISA的的基基本本原原理理是是利利用用酶标记抗抗体体或或抗抗原原，使使之之成成为酶标抗抗体体(或或抗抗原原)。这种种酶标抗抗体体或或抗抗原原既既保保留留其其免免疫疫原原性性，又又保保留留酶的的活活
7、性性；中中外外，使使抗抗原原或或抗抗体体固固定定到到某某种种固固相相载体体表表面面并并保保持持其其免免疫疫活活性性，利利用用抗抗原原、抗抗体体复复合合物物的的免免疫疫学学反反就就原原理理来来测定定未未记标的的抗抗原原(或或抗抗体体)。具具体体操操作作时是是把把受受检标本本(检测其其中中的的抗抗体体或或抗抗原原)和和酶标抗抗原原蔌蔌抗抗体体按按不不同同的的步步骤与与固固相相载体体表表面面的的抗抗原原或或抗抗体体起起反反应，经洗洗涤后后使使固固相相载体体上上形形成成的的抗抗原原、抗抗体体复复合合物物与与其其他他物物质分分开开，最最后后结合合到到固固相相载体体上上的的酶量量与与标本本中中的的受受检物
8、物质的的量量成成一一定定的的比比例例。加加入入酶反反应的的底底物物后后，底底物物被被酶催催化化变为有有色色产物物，其其量量与与标本本中中受受检物物质的的量量直直接接相相关关，故故可可根根据据反反应颜色色的的深深浅浅来来进行行定定性性或或定定量分析。量分析。(二二)放射免疫放射免疫测定定(radioimmunoassay)放放射射免免疫疫测定定通通常常用用于于测定定组织液液和和血血液液中中的的激激素素水水平平。放放射射免免疫疫分分析析多多数数用用125I来来标记抗抗体体。被被检测抗抗原原即即未未标记物物，通通常常吸吸附附在在固固相相载体体中中，如如多多孔孔酶联塑塑料料板板或或试管管中中。在在此此
9、固固相相载体体中中标记的的特特异异性性抗抗体体与与特特定定的的未未标记抗抗原原产生生特特异异性性免免疫疫结合合。非非特特异异性性吸吸附附可可以以通通过加加入入过量量的的非非特特异异性性卵卵磷磷脂脂蛋蛋白白或或洗洗涤液液来来封封闭。未未结合合的的标记抗抗体体则用用洗洗液液去去除除。最最终特特异异性性结合合的的抗抗原原、抗抗体体复复合合物物残残留留在在反反应板或板或试管中。用管中。用125I标记的抗体，其放射性的抗体，其放射性强度可以直接度可以直接测定。定。(三三)免疫免疫荧光技光技术(immunofluorescence technology)免免疫疫荧光光技技术的的原原理理是是将将荧光光色色素
10、素与与特特异异性性抗抗体体(或或抗抗原原，但但少少用用)以以化化学学的的方方式式结合合起起来来，但但不不影影响响该血血清清抗抗体体的的免免疫疫特特性性。而而后后将将荧光光标记了了的的抗抗体体作作为一一个个试剂，在在特特定定的的条条件件下下浸浸染染标本本，使使之之与与标本本中中相相应的的抗抗原原产生生结合合反反应。这个个反反应的的结果果含含有有荧光光标记的的抗原、抗体抗原、抗体结合物，可用合物，可用荧光光显微微镜来来观察之。察之。(四四)免疫免疫组织化学技化学技术(immunolhistochemistry)检测组织切切片片中中蛋蛋白白分分子子在在细胞胞中中分分布布的的另另一一种种方方法法(类似
11、似于于免免疫疫荧光光技技术)为免免疫疫组织化化学学技技术。该方方法法是是用用化化学学的的方方法法将将酶与与抗抗体体结合合起起来来(类似似于于ELISA)，然然后后将将标记的的抗抗体体与与组织切切片片中中的的抗抗原原产生生特特异异性性的的结合合。结合合后后的的抗抗原原、抗抗体体复复合合物物中中含含有有的的酶可可将将再再加加入入的的无无色色酶底底物物通通过化化学学反反应呈呈色色，最最终借借助助显微微镜在在细胞胞、亚细胞胞水水平平检测各种抗原物各种抗原物质及其分析。及其分析。(五五)免疫印迹技免疫印迹技术(immunoblot)免免疫疫印印迹迹技技术也也称称Western blot或或蛋蛋白白印印迹
12、迹技技术(protein blot)，是是20世世纪70年年代代末末80年年代代初初发展展起起来来的的一一种种蛋蛋白白质抗抗原原检测新新技技术。其其基基本本过程程是是将将蛋蛋白白质样品品(如如血血清清或或细胞胞组织碎碎片片)在在凝凝胶胶电泳泳中中分分离离，再再通通过电转染染将将已已分分离离的的蛋蛋白白南南分分子子转移移到到固固相相膜膜上上，然然后后在在固固相相膜膜上上用用标记(放放射射标记或或酶标记)的的特特异异性性抗抗体体检测蛋蛋白白质抗抗原原煤煤。免免疫疫印印迹迹技技术结合合了了凝凝胶胶电泳泳分分辩力力高高和和固固相相免免疫疫测定定敏敏感感、简便便、稳定等定等优点。点。(六六)免疫免疫电泳
13、技泳技术 免免疫疫电泳泳技技术是是电泳泳分分析析与与沉沉淀淀反反应的的结合合产物物。这种种技技术有有两两大大优点点，是是一一加加快快了了没没淀淀反反应的的速速度度，二二是是将将一一些些蛋蛋白白质组分分利利用用其其电荷荷的的不不同同将将其其分分开开，再再分分别与与抗抗体体反反应，以以其其沉沉淀淀线的的最最高高抗抗体体稀稀释度度为该抗体的效价。抗体的效价。1.免疫免疫电泳泳 2.对流免疫流免疫电泳泳 3.火箭免疫火箭免疫电泳泳 4.免疫固定免疫固定电泳泳 5.聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳第三节第三节 细胞免疫学技术细胞免疫学技术一、白一、白细胞的分离胞的分离 血血液液中中红细胞胞与与白白细胞胞比
14、比例例为600:11000:1，两两者者的的比比重不同，其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。重不同，其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。1.自然沉降法自然沉降法 2.聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法二、外周血二、外周血单个核个核细胞的分离胞的分离 外外周周血血单个个核核细胞胞包包括括淋淋巴巴细胞胞和和单核核细胞胞，其其体体积、形形态和和密密度度与与其其他他细胞胞不不同同，红细胞胞和和多多核核白白细胞胞密密度度较大大，为1.09左左右右，而而淋淋巴巴细胞胞和和单核核细胞胞密密度度为，血血小小板板为。为此此利利用用一一种种密密度度介介于于之之间而而近近于于等等渗渗透透的的溶溶液液(分分层液
15、液)做做密密度度梯梯度度离离心心，使使一一定定密密度度的的细胞胞按按相相应密密度度梯梯度度分分布布，从从而而将将各各种种血血细胞胞加加以以分分离离。常常用用的的分分Ficoll和和Percoll两种。两种。三、淋巴三、淋巴细胞及其胞及其亚群的分离群的分离1.纯淋巴淋巴细胞的采集胞的采集2.黏附黏附贴壁法壁法3.磁磁铁吸引法吸引法四、淋巴四、淋巴细胞胞亚群的分离群的分离1.E花花环沉降法沉降法2.尼尼龙毛分离法毛分离法3.亲和板和板结合分离法合分离法4.荧光激活光激活细胞分离胞分离仪分离法分离法5.流式流式细胞分胞分选法法五、淋巴五、淋巴细胞的功能分析胞的功能分析(一一)T细胞功能的胞功能的检测
16、1.T细胞胞转化化试验(1)非抗原性刺激物非抗原性刺激物(2)抗原性刺激物抗原性刺激物2.细胞胞杀伤试验(1)形形态学学检查法法(2)放射性核素法放射性核素法(二二)B细胞功能的胞功能的检测1.B细胞早期活性指胞早期活性指标的的测定定2.溶血空斑形成溶血空斑形成试验3.B细胞增殖能力的胞增殖能力的试验(三三)NK细胞能力的胞能力的检测1.形形态法法2.酶释法法3.荧光法光法4.放射性放射性5.化学化学发光法光法(四四)吞噬吞噬细胞的胞的检测1.中性粒中性粒细胞功能的胞功能的检测(1)细胞运胞运动功能功能检测(2)吞噬和吞噬和杀菌功能的菌功能的检测2.巨噬巨噬细胞功能的胞功能的检测(1)炭粒廓清
17、炭粒廓清试验(2)吞噬功能的吞噬功能的检测(3)巨噬巨噬细胞溶胞溶酶体体酶的的测定定第二十二章第二十二章常用分子生物学相关实验技术及方法常用分子生物学相关实验技术及方法第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应一、一、PCR技技术原理原理 PCR是是一一种种选择性性体体外外扩增增DNA或或RNA片片段段的的方方法法，其其特特异异性性是是由由两两个个人人工工合合成成的的引引物物序序列列决决定定的的。在在DNA聚聚合合酶催催化化的的一一系系列列合合成成反反应中中，用用两两段段寡寡核核苷苷酸酸作作为反反应的的引引物物。一一般般情情况况下下，这两两段段寡寡核核苷苷酸酸引引物物的的序序列列互互不不相相同同，
18、并并分分别与与模模板板进行行加加热变性性。随随之之将将反反应混混合合特特冷冷却却至至某某一一温温度度，使使引引物物与与它它的的靶靶序序列列进行行配配对，称称为退退火火。嗣嗣后后，退退火火引引物物可可在在DNA聚聚合合酶作作用用下下进行行延延伸伸。上上述述过程程是是由由温温度度控控制制的的。这种种热变性性-复复性性-延延伸伸的的过程程就就是是一一个个PCR循循环。PCR是在合适条件下的是在合适条件下的这种循种循环的不断重复。的不断重复。(一一)高温高温变性性 基基因因组模模板板DNA加加热至至90-95度度，可可使使DNA双双螺螺旋旋结构构解解链成成为单链。(二二)低温退火低温退火 将将反反应混
19、混合合物物降降温温，使使引引物物与与单链DNA模模板板(或或从从mRNA反反转录而而来来的的cDNA)上上的的互互补序序列列得得性性，形形成成模模板板-引引物物复复合合物物谷谷称称退退火火，是是DNA复制的固定起点。复制的固定起点。(三三)中温延伸中温延伸 在在DNA的合成的合成过程中，程中，链的延伸温度在的延伸温度在60-72度。度。二、二、PCR分分类1.经典典PCR2.反反转录PCR3.免疫免疫PCR第二节第二节 生物芯片技术生物芯片技术 生生物物芯芯片片是是指指在在面面积不不同同的的基基片片（玻玻璃璃、硅硅片片、尼尼龙膜膜、金金属属、凝凝胶胶等等）表表面面上上有有序序地地点点阵排排列列
20、了了一一系系列列识另另分分子子(cDNA、DNA、肽、蛋蛋白白质或或寡寡核核苷苷酶等等)，固固定定在在每每一一点点阵上上的的分分子子都都是是可可寻址址的的；然然后后在在相相同同条条件件下下，点点阵上上的的分分子子与与其其“配配体体”分分子子反反应，反反应结果果用用核核素素、荧光光、化化学学发光光或或酶标法法显示示，通通过计算算机机软件分析，件分析，综合在可合在可读的的IC总信息。信息。第三节第三节 转基因动物转基因动物一、一、转基因基因动物的概念及物的概念及发展史展史转基基因因动物物(transgeni animal)是是指指所所有有细胞胞基基因因组中中稳定定地地整整合合由由人人工工导入入的的
21、外外源源基基因因，能能正正常常表表达达并并能能遗传给后后代代的的一一类动物物。仅有有部部分分组织细胞胞的的基基因因组中中整整合合有有外外源源基基因因的的动物物，称称为嵌嵌合合体体动物物(chimera animal)。二、二、转基因基因动物技物技术 转基基因因动物物技技术的的基基本本原原理理：将将经过基基因因工工程程改改造造过的的目目的的基基因因（或或基基因因组片片段段，或或人人工工染染色色体体），用用不不同同的的基基因因转移移方方法法导入入供供体体动物物的的受受精精卵卵（或或早早期期胚胚胎胎细胞胞），然然后后将将此此卵卵或或细胞胞植植入入代代孕孕母母体体动物物的的输卵卵管管（或或子子宫）中中
22、，使使其其孕孕育育成成熟熟，产下下携携带有外源基因的有外源基因的转基因基因动物。物。产生生转基因基因动物的关物的关键技技术包括：包括：1.外源目的基因的外源目的基因的获得和构建（含人工染色体）；得和构建（含人工染色体）；2.将外源目的基因有效地将外源目的基因有效地导入生殖入生殖细胞或胚胎干胞或胚胎干细胞；胞；3.利用合适的宿主利用合适的宿主动物或体外培养系物或体外培养系统，使，使转基因胚胎基因胚胎发育；育；4.鉴定、定、筛选理想的理想的转基因基因动物品系。物品系。制制备转基因基因动物的物的转基因方法主要包括：基因方法主要包括：1.显微注射法微注射法2.胚胎干胚胎干细胞法胞法3.反反转录病毒病毒载体法体法4.精子精子载体法体法5.其他方法其他方法