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1、LOGOmicroRNA在医学中的应用在医学中的应用内容内容miRNAmiRNA的研究方法和技术的研究方法和技术 miRNAmiRNA在医学中的应用在医学中的应用展望展望概述概述概述概述miRNA的发现、概念、命名的发现、概念、命名miRNA分子的起源于加工分子的起源于加工miRNA分子的功能特性分子的功能特性3小分子小分子RNA的简介的简介124小分子小分子RNA 小RNA分子本身包含了若干类RNA，根据小RNA 的生成、结构和功能大约可分为以下三类：a miRNA （microRNA)b siRNA (short interfering RNA)c 其他小RNAmicroRNA的发现的发现
2、v1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫中发现第一个可时序调控胚胎后期发育的miRNA lin-4；2002年，Reinhart等又在线虫中发现第二个异时性开关miRNA家族 let-7。v迄今为止，研究者们已在拟南芥、线虫、果蝇、小鼠和人等多种生物中发现了数以千计的microRNA分子。v进一步的研究表明，microRNA分子参与了包括发育、细胞分化、细胞凋亡、脂类代谢和激素分泌等多种生理过程，以及包括白血病、肺癌、结肠癌、糖尿病和病毒感染等多种病理过程。v小分子RNA研究，摘取2002年度SCIENCE十大发现第一名的桂冠。概念概念vMicroRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码R
3、NA分子，大约由2125个核苷酸组成。通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译，从而抑制其靶基因的表达。命名命名 全球成立了miRNA文库，对新的miRNA进行了分级和命名：http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/命名规则：1.miRNA简写成miR-NO.,它的基因简写成mir-NO,如miR-155的基因简写成mir-155。2.高度同源的miRNA在NO.后加英文字母（小写，一般从a开始）。3.多基因拷贝的再在后面加-NO.，如miR-2a-1。4.不同物种中同源的miRNA最好用同一个名字，如果一个前体的两个臂分别产生一
4、个miRNA，则根据克隆实验，分清主要(大量)与次要(少量)成熟产物,在次要的后面加“”号，如miR-56和miR-56 (表示量少的)。5.如果不能区分表达量的多少，可做如下表达miR-142-5p（表示5端的臂）。6.在数据库中每个miRNA名称前加上了物种的名称，如has-miR-208。7.植物中的miRNA基因用斜体表示，如MIR156。miRNA分子的形成过程分子的形成过程miRNA的功能的功能 调节内源基因表达调节内源基因表达调节内源基因表达调节内源基因表达参与细胞周期调控参与细胞周期调控参与细胞周期调控参与细胞周期调控参与个体发育过程参与个体发育过程参与个体发育过程参与个体发育
5、过程部分已知功能的miRNA miRNA 靶基因 功能作用 lin-4 Lin-14,lin-28 线虫早期时序发育 let-7 Lin-41,RAS 线虫晚期时序发育 lsy-6 Cog-1 线虫神经系统发育 miR-273 Die-1 线虫神经系统发育 bantam Hid 果蝇细胞凋亡 miR-14 未知 果蝇细胞凋亡及脂类代谢 miR-430 未知 斑马鱼神经发育 miR-196 Hoxb8 人HL-60细胞系想髓系分化 miR-181 未知 小鼠B淋巴细胞分化 miR-375 Mtpn 小鼠胰岛素分泌 miR-15/16 BCL-2 人B淋巴细胞慢性白血病 miR-155 未知 人弥
6、散性大B淋巴瘤 miRNA 靶基因 功能作用 miR-17-92 E2F1 人B细胞淋巴瘤和肺癌 miR-223 NF1A 人粒系分化 miR-23b Hes1 小鼠神经发育 miR-206 Connexin43 鸡骨骼肌发育 miR-169 MtHAP2-1 蒺藜苜蓿结细胞发育 miR-125a/b ERBB2,ERBB3 调节原癌基因的表达 miR-164a 未知 调节拟南芥叶缘形状的发育 miR-1 未知 影响人脂肪基质细胞成肌潜能 miR-133a 未知 人肌细胞发育 miR-9a Sens 调节果蝇感官发育 miR-122 未知 人肝癌发生 miR-156 SPL-3 促进拟南芥由营
7、养期向花期 的转换microRNA的功能范例的功能范例miRNA的研究方法和技术的研究方法和技术 生物信息学分析方法分子生物学研究方法miRNA的生物信息学分析策略的生物信息学分析策略1.获得microRNA的序列信息，包括成熟和前体microRNA(PremicroRNA)序列、microRNA的基因组定位信息、microRNA的基因分布特点，即确定目的microRNA是属于基因间分布性，还是基因内分布性microRNA。2.microRNA基因簇分析，即目的microRNA基因与相邻microRNA基因关系分析。3.microRNA基因的种系发育分析。4.新microRNA基因的预测与生物
8、信息学验证。5.目的microRNA基因的序列分析，包括目的microRNA的启动子预测和转录因子结合位点分析。6.目的microRNA的靶基因预测miRNA的分子生物学研究方法的分子生物学研究方法利用分子生物学技术开展利用分子生物学技术开展microRNA功能研究的策略功能研究的策略microRNA的功能分析的功能分析 miRNA 的上调可用于鉴定功能获得表型；抑制或下调可以研究功能缺失表型。上调与下调的结合可用于鉴定被特定miRNA 调节的基因，以及特定miRNA 参与的细胞进程。主应用包括：miRNA 靶定位点的鉴定和验证 筛选调节某个特定基因表达的miRNAs 筛选影响某个特定细胞进程
9、的miRNAs用于用于microRNA 功能研究的产品功能研究的产品 敲除特异miRNA 活性的最简单方法Anti-miR miRNA Inhibitors 是序列特异的、经化学修饰以专一靶向和敲除特定miRNA 的分子。细胞中miRNA 的上调可以通过转染合成的miRNAs 或表达miRNAs 的质粒来实现。使用合成miRNAs 有几个好处：v对于永生化的细胞，小分子RNA 的转染效率可以接近100%，合成miRNAs 的高效转染对于高通量应用如miRNA 功能筛选尤其有利.v小分子RNA 如miRNA 可以通过电转很容易的进入原代细胞而不会显著引起细胞死亡v合成 miRNA 可以用不同浓度
10、进行转染，利于剂量反应研究v与质粒产生的miRNA 不同，参与翻译调控的合成miRNA分子的序列是确定的。由于miRNA 剪切和激活机制尚未完全明确，目前仍难以保证由质粒表达的目标miRNA 分子的加工和激活。合成的microRNA与其它方法的比较由质粒产生的microRNAmicroRNA研究方法在医学中的应用研究方法在医学中的应用 miRNA与疾病关系的研究方式分为两类：建立microRNA差异表达谱对疾病发生进行预测和诊断；研究microRNA对疾病发生的分子机制。microRNA与肿瘤与肿瘤vmiRNA 表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作用。v大约50%的
11、得到注解的miRNAs 在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site）。v高通量的microRNA方法是研究microRNA在肿瘤中表达谱的有效方法，现将已见诸报道microRNA基因以不同方式做成探针固定于基质上，与RNA样品杂交，检测样品内microRNA表达水平的改变。miRNA与肿瘤转移与肿瘤转移MicroRNAs 可以起到肿瘤抑制基因和癌基因的作用可以起到肿瘤抑制基因和癌基因的作用目前肿瘤中已完成表达分析及初步功能研究的部分miRNA 肿瘤分类 表达水平 miRNA ID 染色体定位 经验证的 变化趋势 靶基因 胚细胞癌 表达上调 miR-21 17q23.2 TP
12、M1 miR-155 21q21 AGTR1 表达下调 miR-10b 2q31 miR-125b1 11q24.1 Lin-28 miR-145 5q32.33 胶质瘤 表达上调 miR-10b 2q31 miR-130b 11q12 miR-221 Xp11.3 KIT miR125b1,b2 11q24.1,1q11.2 lin-28 miR-9-2 5q14 miR-25 7q22 miR-21 17q23.2 TPM1 miR-123 9q34 肿瘤分类 表达水平 miRNA ID 染色体定位 经验证的 变化趋势 靶基因 表达下调 miR-181a,b,c 9q33.1-q34.13
13、,Hox-A11 q31.2-q32.1,q13.3 miR-128 2q21肝细胞癌 表达上调 miR-18 13q31.3 miR-224 Xq23 表达下调 miR-199a1,a2 19p13.2,1q24.3 miR-200a 1p36.33 miR-125a 19q13.41 lin-28 miR-195 17p13.1甲状腺癌 表达上调 miR-146a,b 5q33.3,10q24.32 IRAK1 miR-222 Xp11.3 KIT miR-221 Xp11.3 KIT miR-220 Xp25 miR-181a,b,c 9q33.1-q34.13 Hox-A11 1q31
14、.2-q32.1肿瘤分类 表达水平 miRNA ID 染色体定位 经验证的 变化趋势 靶基因 miR-213 miR-155 21q21 AGTR1 miR-21 17q23.2 TPM1 miR-9-3 15q26.1 miR-219-1 6p21.32 miR-138-1,-2 3p21.33,16q13 miR-345 14q32.2 miR-26a1 3p22.3 肺癌 表达上调 miR-21 17q23.2 TPM1 miR-24-1 9q22.32 miR-126 9q34.3 miR-30a 6q13 miR-143 5q32 ERK5 miR-145 5q32.33 miR-1
15、88 Xp11.23-q11.2 miR-331 12q22肿瘤分类 表达水平 miRNA ID 染色体定位 经验证的 变化趋势 靶基因 表达下调 miR-200b 1p36.33 Let-7 HMGA2,RAS结肠癌 表达上调 miR-223 Xq12 miR-21 17q23.2 TMP1 miR-17 13q31.3 miR-106a,b Xq26.2,7q22.1 表达下调 miR-143 5q32 ERK5 miR-145 5q32.33 miR-195 17p13.1 miR-130a 11q12.1 MAFB miR-331 12q22慢性B淋巴 表达上调 miR-101 1p3
16、1.3细胞白血病 miR-10b 2q31 miR-123 9q34 miR-132 11q12肿瘤分类 表达水平 miRNA ID 染色体定位 经验证的 变化趋势 靶基因 miR-134 14q32 Limk1 miR-140 16q22.1 Histone deacetylase4 miR-141 12p13 miR-153-precusor 2q36 miR-154 14q32 miR-188 Xp11.23-q11.2 miR-190 15q21 miR-196-2 12q13 Hoxb8 miR-217 2p16 miR-33 22q13.2 miR-92-1 13q31 表达下调
17、miR-192 11q13 miR-213 1q31.3-q32.1 miR-220 Xp25microRNA与病毒与病毒v病毒作为一种微小的感染介质，缺乏独立的代谢及复制功能，其生命周期的完成离不开合适的宿主所提供的生存环境。v一些动物病毒在其基因组中编码microRNA，这些病毒在感染细胞中表达病毒microRNA 来控制自身和宿主基因表达以优化感染。vmicroRNA可通过抑制宿主体内一些蛋白质表达，借以清除感染及寄居的障碍。vmicroRNA在发挥功能的同时又无免疫原性，使得病毒的寄居更为安全。目前的发现：1.Pfeffer等报道，EB病毒（EBV）编码5个microRNA，每个都能调
18、节病毒基因参与潜伏和宿主细胞基因的表达.2.Sullivan等的研究表明，猴病毒（SV）miRNA 在感染晚期积累，与病毒早期的mRNA完全互补，并且把那些mRNA作为裂解的靶标，这虽减少 T抗原的表达，但是相对于突变缺失SVmiRNA 的病毒并不减少感染病毒的产量.3.与病毒基因组编码miRNA 来增加感染性相对应，感染病毒的细胞也会产生miRNA作用于病毒。Omoto等鉴定了HIV-1感染并且nef转导的细胞中nef表达的miR-N367，并且发现在人T 细胞中miR-N367降低HIV-1LTR启动子的活性，从而抑制HIV-1转录。4.这些研究无疑为我们揭示病毒感染的发病机理开辟了新方向
19、，也为药物设计与针对性治疗提供了潜在目标。编码miRNA的病毒及名称病毒名称 病毒种属 miRNA数目 miRNA名称Herpesvirus EBV 23 miR-BHRF1-(1-3)miR-BART1-20 KSHV 12 miR-K1-12 HCMV 11 miR-UL22-1,miR-US5-1 miR-US5-2,miR-UL36-1 miR-UL112-1,miR-US25-1 miR-US25-2,miR-UL148D-1 miR-US33-1,miR-UL70-1 miR-US4-1 MDV 8 MDV-miR-(1-8)HSV-1 1 miR-LAT MHV68 9 miR-
20、M1-(1-9)rLCV 16 miR-Rl1-(1-16)Polyomavirus SV40 1 miR-S1 Mouse Polyomavirus 1 未命名 SA12 Polyomavirus 1 未命名Adenovirus HAV 1 未命名 HIV HIV-1 1 miR-N367microRNA与与2型糖尿病型糖尿病 2型糖尿病个体典型的特征有高胰岛素血症和高葡萄糖血症，这些代谢紊乱特征与胰岛素的分泌细胞胰岛B细胞，胰岛素的效应组织肌肉、脂肪、肝脏等功能失调密不可分。因此，与肌肉细胞分化成熟、脂肪细胞分化成熟相关的microRNA都有可能最终影响相应组织的生理功能，与胰岛素的分泌密
21、切相关的结论也提示microRNA可能在2型糖尿病的发生发展中发挥一定的功能。目前的发现：1.miR-375能通过其靶基因Mtpn，抑制葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。2.miR-143能促进脂肪合成。3.miR-122也参与调节脂代谢以及miR-181，miR-133，miR-1等能调节肌肉细胞分化。4.miR-192在2型糖尿病小鼠模型中发现肾小球中的表达与正常对照比较升高23倍，可能与糖尿病肾病的发生有一定的联系。microRNA功能研究中的问题与挑战功能研究中的问题与挑战v功能研究的复杂性v新miRNA的发现展望展望vmiRNA在动植物及人类中广泛存在，并且与包括发育、分化、凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症等多种重要生物学过程有联系。v因此，全面而深入地剖析miRNA 的发生、作用机理和功能，将会揭示这些生物过程乃至一些疑难疾病的分子基础。v相信随着研究的不断深入，基于miRNA 的转录后基因沉默将会成功应用于功能基因组学的研究以及肿瘤、病毒感染等的基因治疗。LOGO