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1、酶酶 工工 程程酶工程酶工程(Enzyme Engineering)课程介绍及其学习安排课程介绍及其学习安排基础课程基础课程：生物化学，微生物学，分子生物学。学学 时时：66学时(其中含实验课24学时)。主要内容主要内容：本课程主要讲授酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等方面知识。在此基础上，探讨酶作为一种高效的工业生物催化剂在工程上如何实际应用以及酶作为一种高效的生物大分子在基因工程中的应用问题。讲授方法讲授方法：理论学习与实验课相结合。考核方式考核方式：期末闭卷考试，平时书面作业考察。教教 材：材：郭勇主编，酶工程，科学出版社，2016，
2、第四版，第三版（2009）参考书目：参考书目：陈守文主编，酶工程(普通高等教育十一五规划教材)，科学出版 社，2008，第一版 罗贵民主编，酶工程，化学工业出版社，2002，第一版。袁勤生主编，现代酶学，华东理工大学出版社，2001，第一版。张树政主编，酶制剂工业（上、下册），科学出版社，1998。陈石根等著，酶学，1987，第一版。袁勤生等著，应用酶学，1994，第一版。扬开宇等著，基因表达调控与生物技术中的酶学，1990，第一版。王璋，食品酶学，1990，第一版。DixonM.andWebbE.D.:Enzymes(3rdEd.),Longman,1979.教材及其参考书目教材及其参考书目
3、Applied Biocatalysis(J.M.Cabral,D.Best,L.Boross,T.Tramper,Harwood academic Publishers)Technological Applications of Biocatalysts(Open Universiteit and University of Greenwich,Butterworth-Heinemann)Colin Ratledge,Bjrn Kristiansen,Basic Biotechnology,Cambridge,University Press,2001.酶工程是生物技术的重要组成部分酶工程是
4、生物技术的重要组成部分世界七大高新技术：世界七大高新技术：现代生物技术现代生物技术航天技术航天技术信息技术信息技术激光技术激光技术自动化技术自动化技术新能源技术新能源技术新材料技术新材料技术生物技术的基本内容（几大领域）生物技术的基本内容（几大领域）基因工程：用基因工程：用“剪刀剪刀+糨糊糨糊”创造新物种的工程。创造新物种的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术细胞工程：微观水平的嫁接技术 酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工 厂，将神话变为现实的桥梁。厂，将神话变为现实
5、的桥梁。酶的概念：酶的概念：将一种物质转换为另一种物质将一种物质转换为另一种物质Whohasseenthewind?NeitherInoryou;Butwhentheleaveshangtrembling,Thewindispassingthrough.Whohasseenthewind?NeitheryounorI;Butwhenthetreesbowdowntheirheads,Thewindispassingby.Chapter 1 绪论绪论理论探讨应用研究q酶制剂的生产和应用q开发固定化酶和酶反应器q酶的化学修饰和基因工程改造酶学酶工程q揭示酶结构和功能的关系q酶的催化机制和调节机制q
6、酶和生命活动的关系q酶的设计和改造酶工程的主要内容http:/ 酶的基本概念与发展史酶的基本概念与发展史酶酶是具有生物催化功能的生物大分子是具有生物催化功能的生物大分子酶化学本质：酶化学本质：蛋白质（蛋白质（P酶）和核糖核酸（酶）和核糖核酸（RNA)（R酶）酶）酶工程：酶工程：酶的生产与应用技术酶的生产与应用技术人们对酶的认识经历了一个不断发展、逐步深入的过程。人们对酶的认识经历了一个不断发展、逐步深入的过程。人们对酶的认识经历了一个不断发展、逐步深入的过程。人们对酶的认识经历了一个不断发展、逐步深入的过程。我我国国古古代代对对酶酶的的应应用用 中国古代，已经不自觉地利用酶的催化作用中国古代，
7、已经不自觉地利用酶的催化作用中国古代，已经不自觉地利用酶的催化作用中国古代，已经不自觉地利用酶的催化作用巴克纳活体催化巴斯德非活体催化1833，发现淀粉酶，初步触及酶的性质，发现淀粉酶，初步触及酶的性质酶的催化作用理论:中间产物学说与米氏方程V =Vmax S S+KmE+SESE+Pk1K-1k21902，亨利中间产物学说，亨利中间产物学说1913，米氏方程，米氏方程酶本质的认识:Protein或者RNA(P酶和R酶)1-2 酶催化作用的特点酶催化作用的特点 酶的催化特点催化效率高专一性强作用条件温和酶活可调节最重要的特性，它保证细胞内物质代谢的有序进行；它对酶工程的发展有重要意义。酶的专一
8、性1.绝对专一性q一种酶只能催化一种物质进行一种反应q当酶作用的底物或形成的产物有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种，称为立体异构专一性2.相对专一性q一种酶能催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应酶的结构决定其具有高度专一性酶的结构决定其具有高度专一性键的的专一性一性：有的有的酶只只对底物的某一底物的某一化学化学键发生作用，生作用，而而对这个个键两端的基两端的基团无无严格要求。格要求。这种种专一性称一性称键的的专一性。一性。基基团专一性一性：还有一些有一些酶，不，不仅要求一定的化学要求一定的化学键，而，而且要求且要求该键两端所两端所连的基的基团一方具有一定的一方具有一定的结构，构
9、，对另另一方的要求不一方的要求不严格格。这种种专一性称一性称为基基团专一性。即一性。即对于化合物于化合物A-B间除要求一定的化学除要求一定的化学键外，外，对A或或B结构要构要求求严格。如：胰蛋白格。如：胰蛋白酶可水解可水解肽键，它要求一定是含有，它要求一定是含有Arg或或Lys的的羰基的基的肽键。酶作用专一性假说 锁和钥匙q底物的性质和酶的活性部位是彼此相适合，像钥匙插入它的锁中q两种形状是刚性（rigid）和固定的（fixed），正好互补诱导契合学说诱导契合学说(induced-fit hypothesisinduced-fit hypothesis）酶催化作用效率高酶催化作用效率高酶催化反
10、应可使反应所需的活化能显著降低酶催化反应可使反应所需的活化能显著降低酶催化作用条件温和酶催化作用条件温和原因：原因：1 酶催化作用所需的活化能较低酶催化作用所需的活化能较低2 酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高温、高压、酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高温、高压、或过低或过低pH值等极端条件下，大多数酶会变性失活而值等极端条件下，大多数酶会变性失活而 失去其催化功能失去其催化功能优势：优势：1 节约能源、减少设备投资节约能源、减少设备投资2 优化工作环境和劳动条件优化工作环境和劳动条件3 更环保更环保常温、常压、常温、常压、pH近中性近中性1-3 影响酶催化作用的因素影响酶催化作用的因
11、素1 1 底物浓度的影响（主要因素，米氏方程）底物浓度的影响（主要因素，米氏方程）2 2 酶浓度的影响酶浓度的影响3 3 温度的影响温度的影响4 pH4 pH值的影响值的影响5 5 抑制剂的影响抑制剂的影响一、底物浓度的影响（主要因素）一、底物浓度的影响（主要因素）在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：二、酶浓度的影响二、酶浓度的影响 在一定条件下酶反应的速度与酶的浓度成正比。因为酶催化反应时，首先要与底物形成所谓中间物，即酶底物复合物ES。当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度Vm，如果此时增加酶的浓度，可增加反应速度，酶反应速度与酶浓度成正比
12、关系。反应速度V酶浓度E三、温度的影响三、温度的影响温度对酶反应的影响是双重的：（1）随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大速度为止。（2）随温度升高而使酶逐步变性。故酶总有一个最适反应温度，在这个温度时，酶的活力最高。在10-80常温范围内，酶活力随着反应温度的变化趋势一般可表示如右图。酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响四、四、pH的影响的影响 在一定的pH下,酶具有最大的催化活性，通常称此pH为最适pH。但是需指出，所谓“最适pH”实际上是一个操作参数。在不同pH时活性发生变化的原因主要在
13、于：（1）pH能影响酶分子结构的稳定性。（2）pH能影响酶分子的解离状态。抑制剂对酶催化的影响可逆性抑制 不可逆性抑制抑制剂与酶以非共价键非共价键结合 抑制剂与酶以共价键共价键结合竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制Penicillin 青霉素重金属金属(Hg,Pb)DFP,TPCK Sarin(-Ser)PCMB(-Cys)酶酶的的可逆可逆抑制抑制 竞争性非竞争性反竞争性EE另一结合区竞争结合区抑制剂底 物图解抑制机理及说明I I I I 只与自由的 E 结合，会与 S 竞争；S可克服 I I I I 的抑制。I I I I 可与自由的 E 或已占据有 S 的 ES 结合，S不能克服 I I
14、I I 的抑制。I I I I 只能与 ES 結合，S反而有利 I I I I 的抑制。E+S ES E+P+I I I I I I I I EI I I I +S EI I I IS E+S ES E+P +I I I I EI I I IS XE+S ES E+P+I I I IEI I I I 可逆抑制动力学 竞争性抑制VmaxVm/2Km1Km21uninhibited2competitive1/S1vo1Vmax-1 Km1-1 Km2V =Vmax S S+Km(1+II/Ki)VmaxKm2competitive1uninhibitedS不变增加可逆抑制动力学 非竞争性抑制V =
15、S Vm /(1+II/Ki)S+KmVm1Vm1/2Km1/S1vo1Vm1-1 KmVm2/2Vm21Vm21uninhibited2noncompetitive1uninhibited2noncompetitiveSVmaxKm变小不变可逆抑制动力学 反竞争性抑制vo=S Vm /(1+II/Ki)S+Km/(1+II/Ki)Vm1Vm1/2Km11/S1vo1Vm1-1 Km2Vm2/2Vm21Vm2Km2-1 Km11uninhibited2uncompetitive1uninhibited2uncompetitiveSVmaxKm变小变小 不同情况下的酶反应动力学方程式，以及相比于
16、不存在抑制因素的条件下其Km和Vm的变化情况。酶的不可逆抑制COO-ClHgPara-chloro-mercuribenzoic acid(PCMB)-CH2-SHCysCl-CH2-SCOO-Hg-CH2-OHSerF-Diisopropyl-fluorophosphate(DPF)OCH(CH3)2 F P=O OCH(CH3)2-CH2-O OCH(CH3)2 P=O OCH(CH3)2氯汞化苯甲酸 二异丙基氟磷酸盐（酯二异丙基氟磷酸盐（酯）E+S ES+A A A AEA A+S EA AS E+P 激活剂：激活剂：Ca2、Mg2、Co2、Zn2、Fe2等金属离子或无机负离子等金属离子
17、或无机负离子 激活剂对酶催化的影响1-4 酶的分类与命名酶的分类与命名蛋白类酶（P酶）分类命名核酸类酶（R酶）分类命名1.国际酶学委员会成立时酶命名的混乱情况:一酶多名一酶多名;多酶一名多酶一名;名无其实名无其实;姓氏冠名。姓氏冠名。2.国际酶学委员会对酶命名及酶分类的建议:(1)每种酶都有一个推荐名和一个系统名:推荐名推荐名由底物名称及催化反应类型两部分组由底物名称及催化反应类型两部分组成成,后加一个后加一个“酶酶(ase)”后缀。后缀。系统名系统名包括酶作用的底物包括酶作用的底物,酶作用的基团及催酶作用的基团及催化反应的类型等部分化反应的类型等部分,后加后加“酶酶(ase)”后后缀缀.(2
18、)(2)系统命名法对酶的分类与系统编码系统命名法对酶的分类与系统编码根据酶所催化的反应类型根据酶所催化的反应类型,系统命名法将酶分系统命名法将酶分成成6 6大类大类:1.1.氧化还原酶氧化还原酶,2.,2.转移酶转移酶,3.,3.水解水解酶酶,4.,4.裂合酶裂合酶,5.,5.异构酶异构酶,6.,6.合成酶合成酶(也称连也称连接酶接酶)。每一大类分为若干亚类。每一大类分为若干亚类,每一亚类又每一亚类又分为若干小类。分为若干小类。每种酶都有一个系统编码每种酶都有一个系统编码,形式为形式为“EC.”。EC是是“国际酶学委员会国际酶学委员会”的英文缩写的英文缩写,第一数码第一数码“”表示该酶所属表示
19、该酶所属的大类的大类,第二数码第二数码“”表示所属的亚类表示所属的亚类,第第三数码三数码“”表示所属的小类表示所属的小类,第四数码第四数码“”为该酶在小类中的序号。为该酶在小类中的序号。名称功能催化类型实例1氧化还原酶电子的转移A-+BA+B-醇脱氢酶2转移酶转移功能基团A-B+CA+B-C己糖激酶3水解酶水解反应A-B+H2OA-H+B-OH胰蛋白酶4裂合酶键的断裂通常形成双键丙酮酸脱羧酶5异构酶分子内基团的转移顺丁烯二酸异构酶6连接酶键的形成A+BAB丙酮酸羧化酶 酶的国际分类酶的国际分类A BX YAB+X YA BX YA BY XEC 1.1.3.41 1 大类大类 氧化还原酶氧化还
20、原酶1 1 亚类亚类 CH-OHCH-OH3 3 小类小类 氧为氢受体氧为氢受体 4 4 序号序号 第第 4 4 个个葡萄糖氧化酶Glucose OxidaseEnzyme Commission氧化还原酶 转移酶 水解酶裂合酶 异构酶 合成酶-ase反应类型底物名称+系统命名：推荐名：氧化还原酶类编码中第氧化还原酶类编码中第2 2第第3 3数码意义数码意义第第2数码数码1：作用于供体的：作用于供体的CH-OH基基2：作用于供体的醛基或酮基：作用于供体的醛基或酮基3：作用于供体的：作用于供体的CH-CH基团基团4：作用于供体的：作用于供体的CH-NH2基基5：作用于供体的：作用于供体的CH-NH
21、基基6：作用于：作用于NADH或或NADPH7：作用于其他含氮化物为供体作用于其他含氮化物为供体8：作用于以含硫基团为供体：作用于以含硫基团为供体9：作用于以血红素为供体：作用于以血红素为供体10:作用于以二酚和有关物质为供作用于以二酚和有关物质为供体体11:作用于以作用于以H2O2为供体为供体12:作用于以作用于以H2为供体为供体97：其他氧化还原酶：其他氧化还原酶第第3数码数码1：以：以NAD+或或NADP+为受体为受体2：以细胞色素为受体：以细胞色素为受体3：以：以O2为受体为受体4：以二硫化物为受体：以二硫化物为受体5：以醌或其有关化物为受体：以醌或其有关化物为受体6：以含氮的基团为受
22、体：以含氮的基团为受体7：以铁：以铁-硫蛋白为受体硫蛋白为受体99：其他受体：其他受体核酸类酶（核酸类酶（R R酶）的分类酶）的分类 l自1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定。l根据酶催化反应的类型，可以将R酶分为剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三类。l根据R酶的结构特点不同，可分为锤头型R酶，发夹型R酶，含I型IVS 的R酶，含II型 IVS 的R酶等。l根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子，可以将R酶分为分子内催化（in cis，也称为自我催化）和分子间催化（in trans）两类。1-5 酶活及其测定酶活力酶
23、活力是指在是指在一定条件一定条件下酶所催化的反应速度下酶所催化的反应速度.反应速度用单位时间内底物的消耗量或产物的反应速度用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量表示生成量表示:v=-dS/dt=dP/dt 酶活力测定方法酶活力测定方法q终点法q动力学法q酶偶联法q电化学法检测对象底物减少产物增加辅酶变化 酶活的测定反应反应 检测检测酶与作用底物反应一段时间(1)国际单位国际单位1个国际单位(internationalunit，IU)是指：在特定条件下(最适pH值、25、最适底物浓度、最适缓冲液的离子强度)，1min内能转化1m mol底物所需要的酶量，即1IU1mmol/minKatal 单位
24、单位1972年，国际酶学委员会又推荐一个新的酶单位催化单位，即Katal单位(缩写Kat)。1个Katal单位是指：在最适条件下，1s内能转化lmol底物所需要的酶量，即1Kat单位1mol/s。酶活力单位（酶活力单位（酶活力的高低）酶活力的高低）在特定条件下，每1 mg酶蛋白（或每1 ml酶液）所具有的酶活力单位数。酶活及比活力酶的比活力酶的比活力(纯度纯度)酶的比活力能反映酶制剂的纯度和活力的高低。酶的比活力能反映酶制剂的纯度和活力的高低。固定化酶活力测定固定化酶活力测定1.振荡测定法振荡测定法2.酶柱测定法酶柱测定法3.连续测定法连续测定法4.固定化酶的比活力测定固定化酶的比活力测定（比
25、活力（比活力=酶活力单位酶活力单位/cm2）5.酶结合效率与酶活力回收率的测定酶结合效率与酶活力回收率的测定6.相对酶活力的测定相对酶活力的测定（固定化酶活力（固定化酶活力/游离酶活力）游离酶活力）1-6 酶的生产方法酶的生产方法 酶的生产方法1.1.提取法提取法 原理：从生物组织或细胞中将酶提取分离出来。原理：从生物组织或细胞中将酶提取分离出来。特点：含酶组织或细胞来源困难、工艺路线复杂、特点：含酶组织或细胞来源困难、工艺路线复杂、分离纯化较困难。分离纯化较困难。2.2.生物合成法生物合成法 原理：利用微生物或动植物细胞发酵产生所需要的原理：利用微生物或动植物细胞发酵产生所需要的酶。酶。特点
26、：原料成本低、产量大、不受时间空间和来源特点：原料成本低、产量大、不受时间空间和来源限制。限制。3.3.化学合成法化学合成法 原理：通过化学合成得到酶。原理：通过化学合成得到酶。特点：合成成本高昂，合成种类有限。特点：合成成本高昂，合成种类有限。酶来源用途胰酶、胰脂酶猪、牛胰帮助消化胃蛋白酶胃粘膜帮助消化胰凝乳蛋白酶牛胰抗炎SOD猪牛等红细胞消炎、抗辐射、抗衰老溶菌酶卵清抗炎、抗出血尿激酶男性尿溶血栓纤溶酶人血浆溶血栓凝血酶血浆止血弹性蛋白酶胰降血压 SOD的提取法生产去血浆离心NaCl反复洗3次去离子水5，30min乙醇，氯仿搅拌15min离心丙酮0去离子水60，15min丙酮去离子水0透析
27、68hDEAE-SephadexA50pH7.6磷酸缓冲液梯度洗脱超滤冻干 酶的化学合成 1948年确定了核糖核酸酶分子中的氨基酸排列顺序，证明了化学合成酶的可能性，并阐明蛋白质的结构与功能的关系。于1972年获诺贝尔奖。安芬森(19161995)美国生物化学家梅里菲尔德(1921)美国生物化学家 1965年梅里菲尔德制成了第一台自动化合成仪。1969年他用这台仪器高 速地合成由124个氨基酸残基组成的核糖核酸酶A。核糖核酸酶A是世界上首次 人工合成的酶。他的工作对整个有机合成化学起了极大的推动作用。获1984年诺贝尔奖。1964年，我国人工合成胰岛素。酶的生物合成l1894年，日本高峰让吉首
28、先从米曲霉中制得高峰淀粉酶，用作消化剂（先例）。l1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。l1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。l1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。l此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在5050年代年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。酶的发展概况l1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。l50年代以后,随着生化工
29、程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。l1916年，开始了酶固定化酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。l60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。l1971年，第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。l1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。
30、l1978年,日本的铃木等固定化细胞生产-淀粉酶研究成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期。l80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。l在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技酶分子修饰技术术也取得了进展。l60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变;l70年代,修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展。l1984年，开始酶的非水相催化酶的非水相催化研究，提供新的可能。l90年代，酶的定向进化技术酶的定向进化技术得到发展。l此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。