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1、 层析理论及技术层析理论及技术1.1.层析（层析（chromatographychromatography）：）：层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography）。层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。层析系统分为两个相：固定相和流动相。由层析系统分为两个相：固定相和流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相
2、的推力影于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，故又称色层析法。故又称色层析法。层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。苷酸、糖、蛋白质等。2.2.层析的分类：层析的分类：2.12.1根据两相所处状态：气相层析；固相层析
3、根据两相所处状态：气相层析；固相层析2.22.2根据层析分离机制：吸附层析；分配层析；离子交换层析；根据层析分离机制：吸附层析；分配层析；离子交换层析；凝胶层析；亲和层析凝胶层析；亲和层析2.32.3根据操作形式不同：柱层析；薄层层析；纸层析；薄膜层析根据操作形式不同：柱层析；薄层层析；纸层析；薄膜层析3.3.常用层析方法：常用层析方法：3.13.1薄层层析：薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，薄层层析：薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品点加到薄层上，然后用适当的溶剂展开，而达把要分析的样品点加到薄层上，然后用适当的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。其优点是：设
4、备简单，操作容易；层析到分离、鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易；层析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；分离效率高。色剂，且可以在高温下显色；分离效率高。3.23.2纸层析纸层析:3.33.3凝胶层析：凝胶层析：3.43.4亲和层析：生物体中许多高分子化合物具有与某些亲和层析：生物体中许多高分子化合物具有与某些对应的专一分子可逆结合的特性，例如，酶、蛋白与对应的专一分子可逆结合的特性，例如，酶、蛋白与辅酶，抗原与抗体、酶与酶抑制剂、激素与受体等体辅酶，抗原与抗体、酶与酶抑制剂、激素与受体等
5、体系，都具有这种特性。生物高分子与配体之间形成可系，都具有这种特性。生物高分子与配体之间形成可解离的专一络合物的能力称为亲和力。根据这种具有解离的专一络合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物高分子与配基间可逆性结合和解离的原亲和力的生物高分子与配基间可逆性结合和解离的原理而建立的层析技术称为亲和层析（理而建立的层析技术称为亲和层析（affinity affinity chromatographychromatography）。）。亲和层析的优点是：在温和条件下进行，操作简单，亲和层析的优点是：在温和条件下进行，操作简单，效率高。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最效率高。亲和层析在分
6、离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。佳的方法。3 35 5离子交换层析法（离子交换层析法（ion exchange ion exchange chromatography IECchromatography IEC）是利用离子交换剂对需要分离）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。柱层析称为离子交换层析。离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一性支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一种离子与一固体
7、中的另一种具有相同电荷的离子进行种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同，相互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。它们对交换剂的亲和力就有所差别。实验七：血红蛋白与核黄素的凝胶层析实验七：血红蛋白与核黄素的凝胶层析 实验性质：实验性质：分析性分析性目的要求：目的要求：1.了解凝胶层析法的基本原理应用了解凝胶层析法的基本原理应用 2.掌握凝胶柱层析的基本操作掌握凝胶柱层析的基本操作1.1.概述：概述：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗
8、透层析等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大凝胶渗透层析等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959 1959年，年，PorathPorath和和FlodinFlodin首次用一种多孔聚合物交联葡首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。凝胶过滤。19641964年，年，MooreMoore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流烯
9、凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。高分子化学等很多领域。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、
10、核酸、多糖等生物此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。定、脱盐、样品浓缩等。2.2.实验原理实验原理2.12.1凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴组分的样品进
11、入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者
12、之间的分子在流动中部所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质2.2 2.2 固定相：固定相：交联葡聚糖（交联葡聚糖（sephadex G-5
13、0sephadex G-50）2.3 2.3 流动相：流动相：蒸馏水蒸馏水2.4 2.4 待分离物质：待分离物质：血红蛋白（红色，血红蛋白（红色，MW:MW:6450064500）核黄素（黄色，核黄素（黄色，MW:376MW:376）2.5 2.5 血红蛋白因为分子量较大，洗脱较快；核血红蛋白因为分子量较大，洗脱较快；核黄素则较慢黄素则较慢3.3.操作：操作：3.13.1凝胶准备：凝胶准备：sephadex G-50 1gsephadex G-50 1g加蒸馏水加蒸馏水30ml30ml煮沸煮沸1h1h，冷却，冷却3.23.2柱体积测定：柱体积测定：3.33.3装柱：关闭出口，加装柱：关闭出口，
14、加1/31/3柱蒸馏水；将混匀凝胶倒入，凝胶柱蒸馏水；将混匀凝胶倒入，凝胶沉积后打开出口，排出部分蒸馏水，同时，不断加入凝胶，直沉积后打开出口，排出部分蒸馏水，同时，不断加入凝胶，直至凝胶体积占柱体积的至凝胶体积占柱体积的1/21/2至至2/32/3。（注意：凝胶中防止出现汽。（注意：凝胶中防止出现汽泡和断层，凝胶面要平整）泡和断层，凝胶面要平整）3.43.4加样：打开出口，使蒸镏水恰好与床面相切；关闭出口，加样：打开出口，使蒸镏水恰好与床面相切；关闭出口，沿管壁轻轻加入样品；打开出口，使样品进入床内；加入蒸镏沿管壁轻轻加入样品；打开出口，使样品进入床内；加入蒸镏水。水。3.53.5洗脱：打开出口，不断加入蒸镏水；观察并记录洗脱情况。洗脱：打开出口，不断加入蒸镏水；观察并记录洗脱情况。3.63.6凝胶回收：凝胶回收：4.4.结果：结果：5.5.注意事项：注意事项：6.6.思考题：思考题：7.7.卫生值日：卫生值日：