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1、会计学1七生物化学基因工程七生物化学基因工程TransgenicTransgenicbluerosebluerose第1页/共126页基因重组：基因重组：基因重组是细胞内经常发生的过程，是指整段基因重组是细胞内经常发生的过程，是指整段DNA在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的现象。基因重组又叫在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的现象。基因重组又叫DNA重组重组，是自然界的常见现象。它在物种变异、进化、两性繁殖、基因表达和调控以及基因激活等方面都具有重要作用。，是自然界的常见现象。它在物种变异、进化、
2、两性繁殖、基因表达和调控以及基因激活等方面都具有重要作用。基因工程：基因工程：基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因重组，把重组的基因导入细胞或细菌内，进行复制、转录和翻译。利用这一技术可以扩增基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因重组，把重组的基因导入细胞或细菌内，进行复制、转录和翻译。利用这一技术可以扩增DNA，生产蛋白质，或者创造生物新品种。该技术又称为，生产蛋白质，或者创造生物新品种。该技术又称为重组重组DNA，DNA克隆或分子克隆。克隆或分子克隆。第2页/共126页第第 一一 节节DNA的重组的重组 DNARecombinationDNARecombination第3页/共126
3、页一、概念：一、概念：一、概念：一、概念：基因重组：不同来源的基因重组：不同来源的基因重组：不同来源的基因重组：不同来源的DNADNADNADNA链的断裂和连接而产生的链的断裂和连接而产生的链的断裂和连接而产生的链的断裂和连接而产生的DNADNADNADNA片段的交换和重新组合，形成新的片段的交换和重新组合，形成新的片段的交换和重新组合，形成新的片段的交换和重新组合，形成新的DNADNADNADNA分子的过程。分子的过程。分子的过程。分子的过程。重组类型：重组类型：重组类型：重组类型：同源重组、特异位点重组、转座重组同源重组、特异位点重组、转座重组同源重组、特异位点重组、转座重组同源重组、特异
4、位点重组、转座重组二、二、二、二、同源重组同源重组同源重组同源重组(homologous recombination(homologous recombination(homologous recombination(homologous recombination）（一）概念：（一）概念：（一）概念：（一）概念：发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接再连接再连接再连接,在两个在两个在两个在两个DNADNADNADNA分子同源序列间进行单链或双链片段的分子同源序列间进行单链或
5、双链片段的分子同源序列间进行单链或双链片段的分子同源序列间进行单链或双链片段的交换交换交换交换,称为同源重组又称基本重组。是最基本的称为同源重组又称基本重组。是最基本的称为同源重组又称基本重组。是最基本的称为同源重组又称基本重组。是最基本的DNADNADNADNA重组重组重组重组方式方式方式方式.第4页/共126页（二）同源重组特点：（二）同源重组特点：（二）同源重组特点：（二）同源重组特点：不需要特异不需要特异不需要特异不需要特异DNADNADNADNA序列，而是依赖两分子间序列的序列，而是依赖两分子间序列的序列，而是依赖两分子间序列的序列，而是依赖两分子间序列的相相相相同或相似性（同源性）
6、；同或相似性（同源性）；同或相似性（同源性）；同或相似性（同源性）；并且同源双链并且同源双链并且同源双链并且同源双链DNADNADNADNA分子必须分子必须分子必须分子必须紧密接触紧密接触紧密接触紧密接触，相对应方能，相对应方能，相对应方能，相对应方能交换；交换；交换；交换；重组时，两个重组时，两个重组时，两个重组时，两个DNADNADNADNA片段必须有一个发生片段必须有一个发生片段必须有一个发生片段必须有一个发生断裂或有一断裂或有一断裂或有一断裂或有一段单链缺失。段单链缺失。段单链缺失。段单链缺失。第5页/共126页（三）机制：（三）机制：（三）机制：（三）机制：HollidayHolli
7、day模型；同源重组有模型；同源重组有模型；同源重组有模型；同源重组有4 4个关键步骤个关键步骤个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体两个同源染色体DNADNA排列整齐。排列整齐。排列整齐。排列整齐。一个一个一个一个DNADNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNADNA对应对应对应对应链连接，形成链连接，形成链连接，形成链连接，形成HollidayHolliday中间体。中间体。中间体。中间体。通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNADNA。
8、HollidayHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组中间体切开并修复，形成两个双链重组中间体切开并修复，形成两个双链重组中间体切开并修复，形成两个双链重组体体体体DNADNA。片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)由于切开的方式不同，得到两种不同的产物：由于切开的方式不同，得到两种不同的产物：第6页/共126页片段重组体：片段重组体：（见模型图（见模型图右边右边产物）：产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源
9、双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：拼接重组体：（见模型图（见模型图左边左边产物）：产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。第7页/共126页 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353目目 录录第8页/共126页Holiday中间体中间体5353535353555333555
10、53333555533335555333355553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶拼拼接接重重组组体体片片段段重重组组体体第9页/共126页E.coli同源重组分子机制：同源重组分子机制：需数十种酶参与，其中最关键的是：需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、蛋白、RecBCD复合物及复合物及RuvC蛋白。蛋白。RecA RecA蛋白蛋白是由是由recrec基因编码的，可结合单链基因编码的，可结合单链DNADNA，形成，形成RecARecAss ssDNADNA复合物。复合物。RecARecA蛋白具有多个蛋白具有多个DNADN
11、A结合位点，因此线性结合位点，因此线性RecARecAss ssDNADNA复合物可以通过插入同源的复合物可以通过插入同源的DNADNA双螺旋的大沟，形成三链双螺旋的大沟，形成三链DNADNA中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋DNADNA中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNADNA分子，从而完成分子，从而完成DNADNA重组。重组。第10页/共126页 具有三种酶活性：具有三种酶活性：依赖依赖ATPATP的核酸外切酶；的核酸外切酶；ATPATP增强的核酸内切酶；增强的核酸内切酶；需要需
12、要ATPATP的的解旋酶活性解旋酶活性。利用。利用ATPATP水解提供能量，沿着水解提供能量，沿着DNADNA链运动，并以较快的速度将前方链运动，并以较快的速度将前方DNADNA解旋，当遇到解旋，当遇到CHICHI（因交换位点的（因交换位点的DNA DNA 结构类似于希腊字母结构类似于希腊字母 而得名）位点（而得名）位点（5GCTGGTGG35GCTGGTGG3）时，可在其下游切出）时，可在其下游切出33末端的游离单链。从而使末端的游离单链。从而使DNA DNA 重组成为可能。重组成为可能。RecBCD蛋白蛋白 有内切酶活性，可切开同源重组的中间体有内切酶活性，可切开同源重组的中间体RuvC蛋
13、白蛋白第11页/共126页 首先由首先由RecBRecB、RecCRecC、RecDRecD的复合物使的复合物使DNADNA产生单链切口；产生单链切口；RecARecA蛋白催化单链蛋白催化单链DNADNA对另一双链对另一双链DNADNA的侵入，并与其中的一条链交叉，交叉分支移动，待相交的另一链在的侵入，并与其中的一条链交叉，交叉分支移动，待相交的另一链在RecBCDRecBCD内切酶催化下断裂后，由内切酶催化下断裂后，由DNADNA连接酶连接缺失的远末端，形成连接酶连接缺失的远末端，形成HollidayHolliday中间体；此中间体再经内切酶中间体；此中间体再经内切酶RuvCRuvC切割、切
14、割、DNADNA连接酶连接完成重组。连接酶连接完成重组。E.Coli的同源重组过程的同源重组过程:第12页/共126页(四四四四).).).).功能功能功能功能1.1.在减数分裂过程中，同源染色在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。（群）体的多样性。2.2.是是DNADNA损伤修复的重要机制之一。损伤修复的重要机制之一。第13页/共126页二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细胞胞与与细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（
15、细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌），这这种种类类型型的的DNA转转移移称称为为接接合合作作用用(conjugation)。并并非非所所有有质质粒粒DNA都都能能转转移移，而而是是只只有有某某些些较较大大的的质质粒粒（如如F因因子子）才才能能通通过过接接合合作作用用发发生生转转移移。因因F因因子子含含有有细细菌菌的的性性鞭鞭毛毛蛋蛋白白编编码码基基因因。能能表达形成细菌的表面性鞭毛。表达形成细菌的表面性鞭毛。细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。第14页/共126页可接合质粒如可接合质粒如 F 因子
16、因子(F factor)质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子F+F-性鞭毛连接性鞭毛连接酶切单链酶切单链第15页/共126页（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称称为为转化作用转化作用(transformation)。例例如如：当当细细菌菌破破裂裂溶溶解解（溶溶菌菌）时时，其其裂裂解解的的DNA片片断断可可被被另另一一细细菌菌作作为为外外源源DNA摄摄取取，并并重重组组整整合合进进自自己己的的基基因因组组，随随细细菌菌基基
17、因因一一起起复复制制、转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。第16页/共126页例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。第17页/共126页（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转移及基因重组即为转导作用(transduction)。自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生自然界常见的
18、转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生DNA转移和基因重组。转移和基因重组。过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。第18页/共126页噬菌体噬菌体DNA在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。1.溶菌性生长途径：溶菌性生长途径：第19页/共126页
19、2.溶源菌生长途径：溶源菌生长途径：是噬菌体是噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主整合进宿主染色体，随宿主DNA复制而被动复制，这种整合了噬菌体复制而被动复制，这种整合了噬菌体DNA的细菌称为的细菌称为溶源菌溶源菌。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌体。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌体DNA从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。当原噬菌体从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。当原噬菌体DNA从细菌染色体被切下时，如果有部分宿主从细菌染色体被切下时，如果有部分宿主DNA被随着切下，这种带有宿主被随着切
20、下，这种带有宿主DNA的噬菌体称为的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体。转导噬菌体再次感染细菌时就可将前一宿主。转导噬菌体再次感染细菌时就可将前一宿主DNA转移至新的宿主细胞，发生转导作用。转移至新的宿主细胞，发生转导作用。如图如图如图如图第20页/共126页噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例目目 录录第21页/共126页目目 录录第22页/共126页 概念：概念：在在整整合合酶酶催催化化下下，在在两两个个DNA序序列列的的特特异异位位点点之之间间发发生生的的整整合合作作用用称称为
21、为位位点点特特异异重重组组(site-specific recombination)种类：种类：噬菌体噬菌体DNA的整合的整合;细菌的特异位点重组；细菌的特异位点重组；免疫球蛋白基因的重排；免疫球蛋白基因的重排；转座重组等。转座重组等。三、位点特异重组三、位点特异重组第23页/共126页在在噬菌体噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点特异靶位点发生选择性整合；发生选择性整合；（一）一）噬菌体噬菌体DNA的整
22、合的整合 （了解）（了解）第24页/共126页 2.2.2.2.特异位点：特异位点：特异位点：特异位点：噬菌体重组的特异位点称噬菌体重组的特异位点称噬菌体重组的特异位点称噬菌体重组的特异位点称attP(attachmentattP(attachmentattP(attachmentattP(attachment site phage)site phage)site phage)site phage)，含，含，含，含P P P P、O O O O和和和和PPPP三个序列组三个序列组三个序列组三个序列组成成成成。大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌的重组位点的重组位点的重组位点的重组位点attBatt
23、BattBattB（attachment site attachment site attachment site attachment site bacteriabacteriabacteriabacteria），含），含），含），含B B B B、O O O O和和和和BBBB三个序列。三个序列。三个序列。三个序列。O O O O是是是是15bp15bp15bp15bp的的的的核心序列核心序列核心序列核心序列，是是是是attBattBattBattB和和和和attPattPattPattP所所所所共同的共同的共同的共同的.而其两侧的序列是而其两侧的序列是而其两侧的序列是而其两侧的序列是B
24、B B B，B B B B和和和和P P P P，P,P,P,P,被称为被称为被称为被称为臂臂臂臂。整合酶与两个核心序。整合酶与两个核心序。整合酶与两个核心序。整合酶与两个核心序列都相结合。列都相结合。列都相结合。列都相结合。POPBOB第25页/共126页（2 2）整合宿主因子整合宿主因子（integration host factor integration host factor IHFIHF）由大肠杆菌产生，结合于）由大肠杆菌产生，结合于attPattP，对整合起促进作用。，对整合起促进作用。（3 3）切除酶切除酶（excisionaseexcisionase XisXis ）由）由噬
25、菌体噬菌体xisxis基因编码。指导基因编码。指导噬菌体噬菌体DNADNA从宿主的染色体中切出来。从宿主的染色体中切出来。4.4.过程过程：噬菌体编码整合酶。这个酶能指导噬菌体编码整合酶。这个酶能指导噬菌体噬菌体DNADNA通过通过重组位点重组位点attPattP插入插入E.coliE.coli的重组位点的重组位点attBattB处发生交叉重组，将两个较小的环状处发生交叉重组，将两个较小的环状DNADNA分子变成一个大环。分子变成一个大环。3.3.参与的整合的酶参与的整合的酶 （1 1）整合酶）整合酶（integrase integrase IntInt）：由）：由噬菌体噬菌体intint基因
26、编码，指导基因编码，指导噬菌体噬菌体DNADNA插入到宿主的染色体中。插入到宿主的染色体中。第26页/共126页第27页/共126页 鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H H抗原有两种，分别为抗原有两种，分别为H1H1鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H2H2鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反H H抗原，这种现象称为抗原，这种现象称为鞭毛相转变鞭毛相转变 。这种抗原相位的改变是由一段。这种抗原相位的改变是由一段995bp995bp的的DNAHDNAH片段片段,发生倒位所致。发生倒位所致。（二）细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组 （了解）（了解）1.H片段的组
27、成和功能：片段的组成和功能：两端各有一个两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重组位点的反向重复序列（特异重组位点-hix）。）。中间是中间是hin基因，编码特异的重组酶基因，编码特异的重组酶-倒位酶，催化倒位酶，催化H片段片段倒位重组。倒位重组。hin基因两端各有一个启动子（基因两端各有一个启动子（P），其中一个启动子启动），其中一个启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的H2和和rH1基因表达，分别产生基因表达，分别产生H2鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制远方阻遏蛋白可抑制远方H1基因的表达。因
28、而结果是基因的表达。因而结果是H2表达而表达而H1不表达。不表达。第28页/共126页 以以hixhix为为特异重组位点，在特异重组位点，在倒位酶倒位酶作用下，两个作用下，两个hixhix之间的之间的H片段进行特异位点重组片段进行特异位点重组(倒位倒位)。其结果是。其结果是H2和和rH1基因不表达，基因不表达，因为没有了启动子。但远方的因为没有了启动子。但远方的H1H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，倒位重组的后果是表达基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，倒位重组的后果是表达H1H1鞭毛蛋白而不表达鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛蛋白。因此，鞭毛蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种
29、鞭毛蛋白质沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1H1和和H2H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不表达两种。的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不表达两种。2.倒位重组及后果：倒位重组及后果：第29页/共126页例例：细菌的特异位点重组：细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 1221第30页/共126页（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)(Ig)，由由两两条条轻轻链链(L(L链链)和和两两条条重重链链(H(H链链)组组成成，分分别别由由三三个个独独立立的的基基因因族族编编码码
30、，其其中中两两个个编编码码轻轻链链(和和)，一一个个编编码码重重链链。轻轻链链的的基基因因族族上上分分别别有有L L、V V、J J、C C四四类类基基因因片片段段。L-L-前前导导片片段段；V-V-可可变变片片段段；J-J-连连接接片片段段；C-C-恒恒定定片片段段。重重链链的的基基因因族族上上有有L L、V V、D D、J J、C C五类基因片段，五类基因片段，D-D-多样性片段。多样性片段。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 第31页/共126页重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因的基因
31、的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，片段的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的片段的两侧均存在保守的重组信号序列重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)第32页/共126页CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段回文七核苷酸序列回文七核苷酸序列富含富含A九核苷酸序列九核苷酸序列间隔间隔其其九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。催化此重排的重组酶
32、基因催化此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质共有两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。RAG1识别识别信号序列，然后信号序列，然后RAG2加入形成复合物，共同促进重排。抗体基因片段的连接过程加入形成复合物，共同促进重排。抗体基因片段的连接过程如图如图。第33页/共126页V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过过程程目目 录录第34页/共126页四、转
33、座重组四、转座重组有有些些基基因因可可从从基基因因组组的的一一个个位位置置转转移移到到另另一一位位置置，这这些些可可移移动动的的DNA序序列列包包括括有有插插入入序序列列和和转转座座子子。由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因移位或重排称为转座因移位或重排称为转座(transposition)。第35页/共126页 1.插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：是一大约长是一大约长7501500bp的的DNA片断。其中包括：片断。其中包括：二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列；序列；两翼有特有的正向
34、重复序列；两翼有特有的正向重复序列；一个转座酶一个转座酶（transposase)编码基因，能表达转座酶引起转座。编码基因，能表达转座酶引起转座。IRTransposase GeneIR 2.转座形式：转座形式：保守性转座：是指插入序列从原位迁移到新位。保守性转座：是指插入序列从原位迁移到新位。复制性转座：是指插入序列复制后，其中一个复制品迁移到新位，另一个原位不动。复制性转座：是指插入序列复制后，其中一个复制品迁移到新位，另一个原位不动。（一）插入序列转座（一）插入序列转座第36页/共126页插插入入序序列列的的复复制制性性转转座座目目 录录第37页/共126页 1.转座子转座子(trans
35、posons)概念：概念：可从一个染色体位点转可从一个染色体位点转 移到另一位点的分散的重复序列。移到另一位点的分散的重复序列。2.转座子组成：转座子组成：两个两个反向重复序列；反向重复序列；转座酶编码基因，其产物引起转座酶编码基因，其产物引起转座。转座。抗生素抗性基因等有用的基抗生素抗性基因等有用的基因。因。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子插入新的靶位点的过程包括：在靶位点交错切割转座子插入新的靶位点的过程包括：在靶位点交错切割DNADNA，将转座子同靶位点的突出末端连接起来，以及补齐缺口、致使靶位点出现正向重复序列。，将转座子
36、同靶位点的突出末端连接起来，以及补齐缺口、致使靶位点出现正向重复序列。第38页/共126页第39页/共126页由转座子介导的转座由转座子介导的转座目目 录录第40页/共126页转座对生物体的影响转座对生物体的影响转座对生物体的影响转座对生物体的影响(1)(1)(1)(1)致死性转座致死性转座致死性转座致死性转座：当各种：当各种：当各种：当各种IS,TnIS,TnIS,TnIS,Tn等转座等转座等转座等转座因子插入到某一基因中后，此基因的因子插入到某一基因中后，此基因的因子插入到某一基因中后，此基因的因子插入到某一基因中后，此基因的功能丧失，发生突变。严重的话可导功能丧失，发生突变。严重的话可导
37、功能丧失，发生突变。严重的话可导功能丧失，发生突变。严重的话可导致生物体死亡。致生物体死亡。致生物体死亡。致生物体死亡。（2 2 2 2）改变生物表型改变生物表型改变生物表型改变生物表型：（3 3 3 3）促进生物进化促进生物进化促进生物进化促进生物进化：第41页/共126页第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNARecombinationTechnique第42页/共126页第43页/共126页重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构
38、建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗斯林研究所成功的克隆了英国罗斯林研究所成功的克隆了“多莉多莉”羊。羊。所有这些工作的基础都是所有这些工作的基础都是重组重组DNA技术技术。重组。重组DNA技术就是技术就是基因工程基因工程，是对基因进行设计和改，是对基因进行设计和改造
39、的分子工程，包括造的分子工程，包括基因重组、基因克隆和克隆基因重组、基因克隆和克隆基因的表达基因的表达。第44页/共126页一、重组一、重组一、重组一、重组DNADNA技术相关概念技术相关概念技术相关概念技术相关概念 1.克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。2.克隆化克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化 (cloning)，即无性繁殖。，即无性繁殖。3.克隆技术水平：克隆技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆。在分子水平上进行。在分子水平上进行。细胞克
40、隆。细胞克隆。在细胞水平上进行。在细胞水平上进行。个体克隆个体克隆（动物或植物）（动物或植物）（一）（一）DNA克隆克隆第45页/共126页 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，再从中筛选出含有目的基因的转化子细胞，然后进行扩增、提取，获得大量同一，继而通过转化或转染宿主细胞，再从中筛选出含有目的基
41、因的转化子细胞，然后进行扩增、提取，获得大量同一DNA分子，即为分子，即为DNA克隆克隆。也称。也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。4.DNA克隆克隆第46页/共126页基因工程的基本程序基因工程的基本程序基因工程的基本程序是基因工程的基本程序是：（1 1）获取目的基因（外源）获取目的基因（外源DNADNA片段）（片段）（2 2）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（3 3）将杂化载体（）将杂化载体（DNADNA重组体）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上其它基因得以转录和翻译。重组体）引入宿主细胞（受体细胞
42、），使目的基因及载体上其它基因得以转录和翻译。载体质粒载体质粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞选出含有重选出含有重组组DNADNA的细的细胞并扩增胞并扩增abbAAb第47页/共126页生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。基因工程基因工程目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称
43、基因工程，又称实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组重组DNA工艺学工艺学。第48页/共126页（二）工具酶（二）工具酶（二）工具酶（二）工具酶n n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n n DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶n n 逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶n n T4DNAT4DNA连接酶连接酶连接酶连接酶n n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶n n 末端转移酶末端转移酶末端转移酶末端转移酶n n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶在重组在重组DNA操作过程中，首先必备的工具就是各种工具酶。例如：操作过程中
44、，首先必备的工具就是各种工具酶。例如：第49页/共126页重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合
45、酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第50页/共126页W
46、erner ArberWerner ArberWerner ArberWerner Arber瑞士瑞士瑞士瑞士Hamilton O.SmithHamilton O.Smith美美国人国人 Daniel Nathans Daniel Nathans 美美国人国人 发现发现限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶及其在分子遗传学方面的应用及其在分子遗传学方面的应用,1978,1978年共获诺贝尔奖。年共获诺贝尔奖。第51页/共126页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.定义定义限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是能能
47、识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bam H第52页/共126页 3.作用：作用：在在细细菌菌体体内内与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保保护护自自身身DNA。对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。2.分类：分类：限制性核酸内切酶已发现限制性核酸内切酶已发现1800种之多。根据种之多。根据酶的组成，所需因子及裂解酶的组成，所需因子及裂解DNA方式不同，可
48、分方式不同，可分为三类：为三类：、型。（基因工程技术中常用型。（基因工程技术中常用型）型）第53页/共126页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示该酶发现的先后次序。用罗马数字表示该酶发现的先后次序。4.酶的命名：酶的命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶通常用三个斜体字母的略语表示。通常用三个斜体字母的略语表示。第
49、54页/共126页 5.5.类酶识别类酶识别DNADNA序列特点序列特点 回文结构回文结构 6.6.平头或钝性末端、粘性末端：平头或钝性末端、粘性末端：平头或钝性末端：平头或钝性末端：有些限制性核酸内切酶可在同一水平上切断有些限制性核酸内切酶可在同一水平上切断DNADNA双链，即形成平头或钝性末端。双链，即形成平头或钝性末端。GGGGAAT TCCCCCCCCT TAAGGGGHindGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+第55页/共126页GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Bam H粘性末端：粘性末端：有些酶在切割有些酶在切割DNA双链时，在两条链切口错开数个核苷
50、酸，从而形成突出的双链时，在两条链切口错开数个核苷酸，从而形成突出的3粘性末端或粘性末端或5粘性末端。粘性末端。第56页/共126页 作用模式图作用模式图产生产生33突出突出粘性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*553355335 53 33355OHP P*C T G C A*G55333 355OHP PA C G T C*G*第57页/共126页 作用模式图作用模式图产生平末端产生平末端(blunt end)Alu I*AGCT*TCGA*553 3553355333355OHP*AG*TC55333355 OHPCT*GA*第58页/共126页 不同的限制性内切酶识别