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1、白血病免疫(miny)(miny)分型宁波二院 李学雷第一页，共三十三页。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些列及其分化程度相关的特异性。因此，这些(zhxi)(zhxi)抗原的表达抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系
2、统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。由于白血病细胞具有肿瘤细表达谱对白血病进行免疫分型。由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常血细胞，常可出现某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不某些抗原缺乏、过度表达、系列交叉表达某一系列或阶段不应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂性。白血病应有的抗原，这又增加了白血病免疫分型的复杂
3、性。白血病/淋巴瘤的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重淋巴瘤的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。要标准之一。第二页，共三十三页。早年曾用过的荧光显微镜或早年曾用过的荧光显微镜或APAAPAPAAP方法基本被废弃。国际上公认方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（的通用的方法是流式细胞术（FCMFCM）。流式细胞术（）。流式细胞术（FCMFCM）白血）白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAbMcAb）作分子探）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和
4、细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。因为因为FCMFCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜，浆，核的抗原表达。核的抗原表达。另一个重要理由是至今尚未发现白血病另一个重要理由是至今尚未发现白血病/淋巴瘤的特异抗原。所以能淋巴瘤的特异抗原。所以能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成(xngchng)(xngchng)的分的分化阻断学说即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成化阻断学说即白血病
5、细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成(xngchng)(xngchng)不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。抗原表达与其相应系列不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。抗原表达与其相应系列/阶段的血细胞无明显差异。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来阶段的血细胞无明显差异。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性。判断病变细胞的属性。第三页，共三十三页。单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来单参数免疫标志测定易将正常细胞包括在内。因此，近年来主张用设门（主张用设门（gatinggating）方法。即用）方法。即用CD45CD45与侧向角与侧向角（sidescatter
6、,SSCsidescatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是群，其理论依据是CD45CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blastsblasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达胞）不表达CD45CD45。SSCSSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细
7、胞反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSCSSC最最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blastsblasts，红细胞。以，红细胞。以CD45/SSCCD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。若双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。若同时加上一个，二个甚或三个荧光同时加上一个，二个甚或三个荧光(ynggung)(ynggung)标记的单抗，则标记的单抗，则很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常很容易识别非正常细胞群所表达的抗原。这样可以排除正常细胞的干扰。在幼稚细胞低的情况下或检测残存白血病时细胞的干扰。在幼稚细胞低的情况下或检测残存白血病
8、时尤为必要尤为必要FCMFCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在10000100005000050000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。第四页，共三十三页。一白细胞分化抗原白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（leukocytedifferentiationantigenleukocyt
9、edifferentiationantigen，LDALDA）指指血细胞在分化成熟为不同谱系（血细胞在分化成熟为不同谱系（lineagelineage）、分化的不同阶段及细、分化的不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。它们大都它们大都(ddu)(ddu)为跨膜分子，由胞外区、跨膜区和胞浆区组成；有为跨膜分子，由胞外区、跨膜区和胞浆区组成；有些以些以糖基磷脂酰肌醇糖基磷脂酰肌醇（GPIGPI）“锚锚”在细胞膜上；在细胞膜上；它们大都是蛋白或糖蛋白，少数为碳水化合物它们大都是蛋白或糖蛋白，少数为碳水化合物第五页，共三十三页。二 CD的概念(gi
10、nin)(ginin)、CD分子的分 类、功能及应用CDCD：用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将来自不同实：用以单克隆抗体鉴定为主的聚类分析法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群（ClusterofdifferentiationClusterofdifferentiation，CDCD）。）。并以此代替分化抗原以往并以此代替分化抗原以往的命名的命名。在许多在许多(xdu)(xdu)情况下，单克隆抗体及其识别的相应抗原都用同一个情况下，单克隆抗体及其识别的相应抗原都用同一个CDCD序号。序号。迄今为止，人迄今为止，
11、人CDCD分子的序号已从分子的序号已从CD1CD1命名至命名至CD371CD371，可大致划，可大致划分为分为1414个组。个组。第六页，共三十三页。第七页，共三十三页。CDCD分子分子(fnz)(fnz)的功能的功能：（1 1）免疫应答过程中参与免疫细胞的相互识别；免疫细胞识别抗）免疫应答过程中参与免疫细胞的相互识别；免疫细胞识别抗原、活化、增殖和分化；免疫效应功能的发挥；原、活化、增殖和分化；免疫效应功能的发挥；（2 2）参与造血细胞的分化和造血过程的调控；）参与造血细胞的分化和造血过程的调控；（3 3）参与炎症的发生；）参与炎症的发生；（4 4）参与细胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。）参与细
12、胞的迁移如肿瘤细胞的转移等。第八页，共三十三页。CDCD分子的临床应用分子的临床应用CDCD单克隆抗体可用于单克隆抗体可用于（1 1）阐明）阐明(chnmng)(chnmng)某些疾病的发病机制；某些疾病的发病机制；（2 2）广泛应用于多种疾病的免疫诊断；）广泛应用于多种疾病的免疫诊断；（3 3）治疗移植排斥反应和肿瘤等疾病；）治疗移植排斥反应和肿瘤等疾病；第九页，共三十三页。第十页，共三十三页。第十一页，共三十三页。CD20分子(fnz)(fnz)结构与分布结构与分布(fnb)(fnb)：单链跨膜蛋白，仅表达于：单链跨膜蛋白，仅表达于B B细胞，细胞，早期即表早期即表达，分化为浆细胞后消失达
13、，分化为浆细胞后消失 功能功能：（1 1）参与和调节）参与和调节B B细胞信号转导、生长和分化。细胞信号转导、生长和分化。（2 2）直接参与调节跨膜）直接参与调节跨膜CaCa2+2+的流动。的流动。第十二页，共三十三页。三免疫(miny)(miny)分型常用的免疫(miny)(miny)标志及其意义第十三页，共三十三页。白血病系列白血病系列(xli)(xli)分化抗原分化抗原T T淋巴细胞白血病：淋巴细胞白血病：CD3CD3、CD5CD5、CD7CD7。B B淋巴细胞白血病：淋巴细胞白血病：CD10CD10、CD19CD19、CD22CD22。NKNK淋巴细胞白血病：淋巴细胞白血病：CD16C
14、D16、CD56CD56、CD57CD57。髓系白血病：髓系白血病：CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33、MPOMPO（髓过氧化物（髓过氧化物(uynhu(uynhuw)w)酶）。酶）。红白血病：红白血病：GlyAGlyA（血型糖蛋白（血型糖蛋白A A）。）。巨核细胞白血病：巨核细胞白血病：CD41CD41、CD42CD42、CD61CD61。第十四页，共三十三页。白血病系列白血病系列(xli)(xli)非特异性抗原非特异性抗原CD34CD34、HLAHLADRDR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38CD38联合联合(linh)(linh
15、)运用于免疫分型。一般而言，干运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞祖细胞CD34CD34、HLAHLADRDR、CD38CD38，原始细胞，原始细胞CD34CD34、HLAHLADRDR、CD38CD38，而幼稚细胞（如早幼粒细胞），而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34CD34、HLAHLADRDR、CD38CD38。第十五页，共三十三页。白血病分化(fnhu)(fnhu)阶段抗原 T T细细胞胞(xbo(xbo)抗原：抗原：CD4CD4、CD8CD8。B B细胞抗原：细胞抗原：CD10CD10、CyCy（胞浆（胞浆 链）、链）、SmIgSmIg（表面膜免疫（表面膜免疫球蛋白）、球蛋白）、CD3
16、8CD38和和CyICyIg g（胞浆免疫球蛋白）、（胞浆免疫球蛋白）、CD11CCD11C。第十六页，共三十三页。白细胞共同白细胞共同(gngtng)(gngtng)抗原抗原CD45CD45为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达为白细胞共同抗原，但原幼细胞表达(biod)(biod)量比成熟淋巴量比成熟淋巴细胞低，幼红细胞不表达细胞低，幼红细胞不表达(biod)(biod)。用。用SSC/CD45PerCPSSC/CD45PerCP双参数分双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性列或阶段特异性McAbMcAb
17、加加CD45CD45进行三色免疫荧光染色，经进行三色免疫荧光染色，经FSCFSC、SSCSSC、McAbl-FITCMcAbl-FITC、McAb2-PEMcAb2-PE、CD45PerCPCD45PerCP五参数分析，可特五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。第十七页，共三十三页。四白血病免疫(miny)(miny)分型急性(jxng)(jxng)髓系细胞白血病第十八页，共三十三页。MOMoblastsMOMoblasts有低的有低的SSCSSC和和FSCFSC。在。在CD45CD45SSCSSC图上出图上
18、出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志(biozh)(biozh)如如CD13CD13或或CD116CD116，但，但MPOMPO比比CD13CD13与与CD33CD33更灵敏。一般淋系更灵敏。一般淋系标志标志(biozh)(biozh)阴性，但也可表达阴性，但也可表达CD7CD7或或CD4CD4。MoblastsMoblasts一般一般HLAHLADRDR、CD34CD34阳性，有些研究表明阳性，有些研究表明CD7CD7与与CD34CD34共表达在共表达在AMLAML且预后差。且预后差。第十九页，共三十三页。M1M1流式上流式上M1M1与与M0
19、M0相似不易区分，相似不易区分，M1M1一般一般(ybn)(ybn)CD13CD13、CD33CD33、HLAHLADRDR，但，但CD34CD34表达少于表达少于M0M0，可能，可能表达部分表达部分CD15CD15。M2M2M2M2与与M1M1要区别是成熟度增加，要区别是成熟度增加，blastsblasts减少，减少，CD15CD15较较M1M1较显著，较显著，CD34CD34弱于弱于M1M1，CD13CD13有时表达强于有时表达强于CD33CD33，多数病例多数病例HLAHLADRDR（-）。）。CD45CD45SSCSSC图显示从髓系图显示从髓系blastblast区至成熟骨髓细胞区的连
20、续细胞带，区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45CD45SSCSSC图有助于图有助于确定确定blastsblasts比例。比例。第二十页，共三十三页。M3M3高颗粒性，具较高的高颗粒性，具较高的SSCSSC，但，但CD45CD45较成熟细胞少，较成熟细胞少，多数情况多数情况(qngkung)(qngkung)HLAHLADRDR（-）或表达减少，）或表达减少，CD34CD34少于少于M2M2、一般、一般CD13CD13弱（），可有弱（），可有CD2CD2表达。表达。第二十一页，共三十三页。M4与M5两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和S
21、SC，CD45SSC图上，成熟C出现(chxin)(chxin)在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLADR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能为M5，但只出现(chxin)(chxin)在少数病人中，部分M5可见CD56（）。第二十二页，共三十三页。M6M6M6M6较少见且特征不明显，一般较少见且特征不明显，一般HLAHLADRDR，CD34CD34、CD13CD13、CD33CD33阳性，阳性，CD45CD45SSCSSC图显示主要为红系成图显示主要为红系成份。份。M7M7巨核细胞白血病，在巨核细胞白血病，在AMLAML中
22、少于中少于1 1。一般。一般CD61CD61（GpGpa a）和）和/或或CD41CD41（GpGpb-b-a a）阳性，而注意）阳性，而注意由于血小板粘附在由于血小板粘附在blastsblasts上造成的假阳性，可以用流式双上造成的假阳性，可以用流式双色分析在色分析在EDTAEDTA存在存在(cnzi)(cnzi)下，测下，测p pb/b/a a与与CD34CD34以减少激以减少激活血小板的粘附。活血小板的粘附。第二十三页，共三十三页。急性(jxng)(jxng)淋巴细胞白血病ALLALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的2525，在，在成人，成
23、人，ALLALL约占急性白血病的约占急性白血病的2525，我们将，我们将ALLALL分为分为(fnwi)(fnwi)B B祖细胞型，祖细胞型，CD10CD10或或CD10CD10，前，前B B细胞型，细胞型，B B细胞型，细胞型，T T细细胞型胞型第二十四页，共三十三页。B B祖细胞型祖细胞型ALLALL：在幼儿约占：在幼儿约占ALLALL的的65657070，青少年为，青少年为55556060，人为，人为5050。在儿童，约。在儿童，约9090病例病例CD10CD10，在，在幼儿只有少于幼儿只有少于5050病例病例CD10CD10，blastsblasts一般一般FSCFSC、SSCSSC很
24、很少，是少，是FABFAB标准的标准的L1L1或或L2L2，一般，一般TdT(+)HLA-DR(+)TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)CD19(+)，此型又分为，此型又分为2 2个亚型，个亚型，CD10CD10和和CD10CD10，前者，前者预后好，多数病例预后好，多数病例CD24CD24，CD34CD34，CD20CD20表达随成熟度表达随成熟度增加增加(zngji)(zngji)而增加而增加(zngji)(zngji)，B B祖细胞被定义为祖细胞被定义为sIg-sIg-。第二十五页，共三十三页。前B细胞型ALL：此亚型约占儿童ALL的25，细胞一般为CD19，CD24，HLAD
25、R，胞浆CD22，CD10，TdT随CD20变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为(rnwi)(rnwi)比B祖型预后更差，这与t(1；19)出现相关并由此产生E2APBX1融合蛋白，它的表型为CD19、CD10、CD9，不同程度CD20表达，CD34，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。第二十六页，共三十三页。B细胞型ALL：成熟B细胞型ALL约占ALL25，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数(dush)(dush)为IGM）多数(dush)
26、(dush)病例CD10。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL，极少数成熟B细胞ALL无FABL3形态。第二十七页，共三十三页。T-ALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3CD4/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞亚型，表达CD7胞浆CD3且无其它(qt)(qt)T细
27、胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它(qt)(qt)异常抗原组合。第二十八页，共三十三页。杂合型白血病：随着流式技术的广泛应用，我们发现杂合型白血病：随着流式技术的广泛应用，我们发现(fxin)(fxin)许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为双表型病人多为t(9t(9；22)22)或（或（11q2311q23），现在杂合型的），现在杂合型的误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，
28、忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B B系、系、T T系、系、髓系分别为髓系分别为CD22CD22、CD3CD3和和MPOMPO。第二十九页，共三十三页。慢性(mnxng)(mnxng)粒细胞白血病由于慢性期显著的细胞分化，在由于慢性期显著的细胞分化，在CD45CD45SSCSSC图上除了髓系细胞图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，占主导外，只显示一个正常骨髓像，CMLCML可确诊，可确诊，CMLCML起病与起病与发展相对缓慢，慢性期的持续发展相对缓慢，慢性期的持续1 1年左右最终年左右最终(zuzhn)(zuzhn)发展为加速
29、发展为加速期和急变期。流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。期和急变期。流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。直接影响到治疗效果。直接影响到治疗效果。急变期急变期CMLCML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10CD10B B祖祖细胞细胞ALLALL极少有极少有T T细胞型细胞型ALLALL。第三十页，共三十三页。慢性(mnxng)(mnxng)淋巴细胞白血病 CLLCLL细胞主要为较正常细胞主要为较正常(zhngchng)(zh
30、ngchng)淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主要为：免疫分型主要为：SIgMSIgM、SIgDSIgD弱表达，部分患者弱表达，部分患者FMC7FMC7弱表达，弱表达，B B系抗原为系抗原为CD19CD19、CD20CD20、CD43CD43、CD79aCD79a与与CD5CD5共表达，共表达，CD23CD23表达使得表达使得CLLCLL区别于套细胞淋巴瘤，即（区别于套细胞淋巴瘤，即（CLLCLL：CD23CD23，MCLMCL：CD23CD23），），CD10CD10、CD11cCD11c和和CD25CD25、CD20CD20常弱表达，尽管常弱表达，尽管CLLCL
31、L起病慢，但起病慢，但CLLCLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病病人的生存率变化很大，有染色体异常的病人预后不良，最常见的三联体人预后不良，最常见的三联体trisony12trisony12、14q14q、13q13q、11q11q，免，免疫表型上没有特异的变化。疫表型上没有特异的变化。CD38+CD38+预后不好。预后不好。对于免疫表型不典型，特别是积分对于免疫表型不典型，特别是积分4,4,需要进行需要进行CCND-1CCND-1的免的免疫组化染色和或利用疫组化染色和或利用FISHFISH检测检测t(11,14)t(11,14)从而与从而与MCLMCL鉴别。鉴别。第三十一页，共三十三页。谢谢！第三十二页，共三十三页。内容(nirng)总结白血病免疫分型。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病/淋巴瘤的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要(zhngyo)标准之一。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。与形态学检查相似仅能根据数量的差异来判断病变细胞的属性第三十三页，共三十三页。