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1、临床分子生物学检验技术临床分子生物学检验技术课程目标课程目标1.通过本章节的学习，使学生能够通过本章节的学习，使学生能够掌握掌握 色谱与质谱技术的概念色谱与质谱技术的概念和技术原理；和技术原理；2.熟悉熟悉色谱与质谱技术、色谱质谱联用技术的应用色谱与质谱技术、色谱质谱联用技术的应用；3.了解色谱与质谱技术的发展趋势了解色谱与质谱技术的发展趋势。色色谱与质谱技术谱与质谱技术案例与问题：案例与问题：2013 2013 年年9 9月至月至2017 2017 年年9 9月，在我国某地区共计月，在我国某地区共计93 39493 394例新生儿接受了例新生儿接受了串联质谱技术（串联质谱技术（MS-MSMS
2、-MS）筛查甲基丙二酸血症）筛查甲基丙二酸血症(methylmalonicmethylmalonic aciduriaaciduria，MMA)MMA)，初筛阳性率约为，初筛阳性率约为1%1%，而最终确诊为，而最终确诊为MMAMMA的新生儿仅为的新生儿仅为10 10 例，统计例，统计MMA MMA 在该地区发病率约为在该地区发病率约为0.011%0.011%。随后该地区某检测平台采用高效液相色。随后该地区某检测平台采用高效液相色谱谱-串联质谱技术（串联质谱技术（HPLC-MS/MSHPLC-MS/MS）对其中收集到的）对其中收集到的MS-MS MS-MS 初筛为阳性的初筛为阳性的423 423
3、 份干血滤纸片标本进行二次筛查，份干血滤纸片标本进行二次筛查，HPLC-MS/MSHPLC-MS/MS检测发现可疑阳性患检测发现可疑阳性患儿儿8 8 例，其中例，其中7 7例经气相色谱质谱联用技术（例经气相色谱质谱联用技术（GC-MSGC-MS）和基因检测证实为）和基因检测证实为MMAMMA，1 1例诊断为继发性例诊断为继发性 MMA(MMA(母亲长期素食母亲长期素食)。最后，通过。最后，通过 MS-MSMS-MS和和HPLC-HPLC-MS/MS MS/MS 的联合应用，使得的联合应用，使得MMAMMA筛查阳性率降为筛查阳性率降为0.013%0.013%，阳性预测值提高至，阳性预测值提高至
4、87.5%87.5%。那么，什么是串联质谱技术、色谱质谱联用技术？它们各自的检。那么，什么是串联质谱技术、色谱质谱联用技术？它们各自的检验技术原理又是什么？它们又有哪些临床应用呢？验技术原理又是什么？它们又有哪些临床应用呢？一、概念一、概念 (basic concept)(basic concept)色谱技术是一组相关分离方法的总称，其主要原理为利用混合物中不同组分的理化性质不同及生物学特性上的差异，使它们在某种基质中移动的速度不同而建立起来的分离和分析方法。第一节第一节 色谱技术色谱技术色谱技术系统都由两个相组成：一是固定相(stationary phase)，是色谱技术中的一个基质，其在色
5、谱分离中固定不动，能与待分离化合物可逆的进行吸附、溶解、交换，是可对分离样品产生保留的相。另一相是流动相(mobile phase)，是色谱分离中携带或推动待分离化合物朝着一个方向移动的相，一般为液体或气体物质。第一节第一节 色谱技术色谱技术二、色谱技术的分类与应用二、色谱技术的分类与应用第一节第一节 色谱技术色谱技术进样系统色谱柱检测系统温度控制区 气相色谱主机载气系统载气系统 数据处理系统数据处理系统图图10-110-1气相色谱仪的基本结构气相色谱仪的基本结构图图10-210-2液相色谱简易流程图输液液泵进样器器 色色谱柱柱柱温箱柱温箱检测器器溶溶剂数据数据处理理废液废液第一节第一节 色谱
6、技术色谱技术二、色谱技术的分类与应用二、色谱技术的分类与应用二、色谱技术的分类与应用二、色谱技术的分类与应用名称名称主要应用范围主要应用范围气相色谱气相色谱易挥发有机化合物的定性和定量分析。在医学检验中GC广泛应用于体液和组织等生物材料中脂肪酸、甘油三酯、维生素、糖类、激素等有机物质的分析。液相色谱液相色谱分析具有高沸点、不易挥发、分子量大、极性强、具有生物活性、热稳定性差的离子型物质和生物大分子等。超临界流体色谱超临界流体色谱 SFC兼具GC和HPLC的特性，同时又优于两者，既可分析GC不适应的高沸点、低挥发性样品，又比HPLC有更快的分析速度和条件。聚焦色谱聚焦色谱纯化制备蛋白质和核酸、鉴
7、定酶的性质、测定蛋白质的等电点、研究蛋白不同异形体等。疏水色谱可作为变性蛋白质复性的有效工具,同时也是研究蛋白折叠的有效途径。一、质谱技术的概念及原理一、质谱技术的概念及原理质谱技术（mass spectrometry）是样品分子或原子被离子化后在质量分析器作用下按照离子质荷比（m/z）的不同分离排列成图谱，然后通过测量各种谱峰的强度实现对各种有机物、无机物分析的一种方法。第二节第二节 质谱技术质谱技术1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.1.离子轰击源2.2.化学电离源3.3.激光表面解析源4.4.软电离源等1.磁偏转2.四级杆3.飞行时间4.傅里叶真空系统真空系统质谱仪的结构组成框图质谱
8、仪的结构组成框图（一）质谱技术在生物大分子分析中的应用（一）质谱技术在生物大分子分析中的应用 1.生物质谱在蛋白质和多肽研究中的应用 2.生物质谱在多糖结构测定中的应用 3.生物质谱在核酸分析中的应用第二节第二节 质谱技术质谱技术二、质谱技术的临床应用二、质谱技术的临床应用（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用 随着质谱技术的不断完善，直至20世纪90年代末，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）首次成功应用于细菌及真菌鉴定。MALDI-TOF MS用于微生物鉴定的原理是检测特征性的具有属、种或亚型生物标志的细菌蛋白质量信号。第二
9、节第二节 质谱技术质谱技术二、质谱技术的临床应用二、质谱技术的临床应用（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用 MALDI-TOF MS 技术鉴定细菌的实验流程简单，一般为三步:先用接种环从培养基中挑取1L纯培养的病原菌，并将其涂布于测试靶板上；然后每个检测孔加 1L基质溶液裂解；最后将靶板放入仪器进行质谱检测结果分析。第二节第二节 质谱技术质谱技术（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用第二节第二节 质谱技术质谱技术（二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用二）质谱技术在临床微生物鉴定中的应用1.1.质谱技术在临床微生物鉴定
10、中存在的优势：质谱技术在临床微生物鉴定中存在的优势：相对于临床微生物其他常用检测技术，MALDI-TOF MS检测的是由病原菌遗传特性决定的、受外界环境影响较小的特征性的蛋白质指纹图谱，因此其测定结果更为快速、准确、直接。例如：由法国生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定分析系统VITEK MS是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。第二节第二节 质谱技术质谱技术1.1.质谱技术在临床微生物鉴定中存在的优势：质谱技术在临床微生物鉴定中存在的优势：VITEK MS采用MALD-TOF MS技术获取细菌蛋白质量图谱并通过细菌数据库对其进行分析，从而完成微生物鉴定。该系统与其他微生物检测
11、系统相比，具有的优势有：自动化程度高、全程自动判读、自动分析、自动报告，人工操作流程简单，无无需革兰染色和配置菌液及挑选板卡等步骤，需革兰染色和配置菌液及挑选板卡等步骤，只需选取微生物点样品板，即可产生MALDI-TOF峰（原始数据），系统进行VITEK MS数据解析，从而获得鉴定结果。第二节第二节 质谱技术质谱技术1.1.质谱技术在临床微生物鉴定中存在的优势：质谱技术在临床微生物鉴定中存在的优势：鉴定速度快，每分钟可完成1-2个菌株的鉴定。高通量，每批同时可进行192个测试。方便质量控制及结果溯源。鉴定种类广，可用于几乎所有类型的病原体鉴定和分类检测。鉴定准确度达95%以上，并于2011年获
12、得欧洲共同体体外诊断认证。运行成本低，无需染色、无需触酶和氧化酶等辅助实验；无需小试剂，如VP试剂、触酶试剂等。第二节第二节 质谱技术质谱技术2.质谱技术在临床微生物鉴定中存在的局限性：MALD-TOF MS技术在微生物鉴定方面由于具有快速、准确、高通量、低成本等多种优势而广泛应用于许多临床微生物实验室。但在现阶段的应用过程中发现其仍存在一定局限性，在分离鉴定同属于一个菌种属、且全基因组平均核苷酸和保守DNA一致率非常高的两种细菌时易出现错误。第二节第二节 质谱技术质谱技术（三）质谱技术在遗传代谢病筛查中的应用（三）质谱技术在遗传代谢病筛查中的应用 MS-MS较传统 IMDIMD筛查技术检出率
13、高，但其对IMDIMD的检测的检测属于初级筛查，后续确诊还需要依赖气相色谱质谱联用(GC-MS)和基因检测的参与。（四）质谱成像技术在临床上的应用（四）质谱成像技术在临床上的应用第二节第二节 质谱技术质谱技术一、色谱质谱联用技术的概念一、色谱质谱联用技术的概念及原理及原理 色谱质谱联用技术是将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析的一种新型技术。第三节第三节 色谱质谱联用技术色谱质谱联用技术 二、色谱质谱联用技术的分类与应用二、色谱质谱联用技术的分类与应用（一）色谱质谱联用技术的分类（一）色谱质谱联用技术的分类 色谱质谱联用技术根据前端色谱仪的不同，主要
14、包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液-质联用与气-质联用互为补充，用于分析不同性质的化合物。第三节第三节 色谱质谱联用技术色谱质谱联用技术 二、色谱质谱联用技术的分类与应用二、色谱质谱联用技术的分类与应用（二）色谱质谱联用技术的应用（二）色谱质谱联用技术的应用 1.新生儿疾病筛查 2.肿瘤标志物检测 3.维生素D检测 4.激素检测 5.血药浓度检测第三节第三节 色谱质谱联用技术色谱质谱联用技术 知识点知识点1 1：色谱技术是一组相关分离方法的总称。色色谱技术是一组相关分离方法的总称。色谱技术分类复杂，不同的色谱技术在应用范围上各有谱技术分类复杂，不同的色谱技术
15、在应用范围上各有优势优势；知识点知识点2 2：质谱技术是根据不同质荷比（质谱技术是根据不同质荷比（m/zm/z）的带电）的带电粒子在电磁场中运动行为的差异而对其进行识别与分粒子在电磁场中运动行为的差异而对其进行识别与分析的检测析的检测；知识点知识点3 3：色谱质谱联用技术是将色谱的分离能力与色谱质谱联用技术是将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析的一种新型技术的定量和定性分析的一种新型技术。Summary1.1.目前色谱技术、质谱技术和色谱质谱联用目前色谱技术、质谱技术和色谱质谱联用技术主要用于医学领域的哪些方面技术主要用于医学领域的哪些方面？2.2.色谱技术、质谱技术和色谱质谱联用技术色谱技术、质谱技术和色谱质谱联用技术在临床应用过程中仍然存在哪些问题在临床应用过程中仍然存在哪些问题？思考与探索思考与探索谢谢观看