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1、实用流式细胞技术及其样品处理实用流式细胞技术及其样品处理FACSAria(FACSDiva)v流式细胞术基本原流式细胞术基本原理理v在不同领域的应用在不同领域的应用v样品及其前处理样品及其前处理一、一、流式细胞术基本原理流式细胞术基本原理OrangeTimeTimeTimeTimeFSCGreenSSCTimeRedGreenData Data ProcessorProcessorSSCFSCOrange 最大特点：单细胞水平的分析最大特点：单细胞水平的分析Blocking capillaryDetector单细胞液流柱的形成单细胞液流柱的形成Injector TipSheathfluidSh
2、eathfluid利用流式细胞术可以获得哪些信息利用流式细胞术可以获得哪些信息细胞的相对计数、绝对计数细胞的相对计数、绝对计数细胞成分的相对定量、绝对定量细胞成分的相对定量、绝对定量单参数或多参数单参数或多参数细胞表面、细胞内成分细胞表面、细胞内成分可溶性成分可溶性成分流式分子表型流式分子表型流式细胞术可以产生哪些信号流式细胞术可以产生哪些信号细胞的物理参数：细胞的物理参数：散射光散射光细胞的理化参数：细胞的理化参数：荧光荧光散射光信号散射光信号FSCSensorLaserSSCSensor前向角散射（前向角散射（FSCFSC）：与球形细胞直径的平方密切相关。）：与球形细胞直径的平方密切相关。
3、侧向角散射（侧向角散射（SSCSSC）：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。neutrophilsbasophilseosinophilsmonocyteslymphocytesneutrophilsmonocyteslymphocytesLaserFSC SSC MonocyteLymphocyteGranulocyteFSCSSC荧光信号荧光信号LaserFSC SensorFluorescence det
4、ector单个细胞的单个细胞的总荧光强度总荧光强度单标样品单标样品Laserlog fluorescence intensitycell number42%positiveAntigen A58%negativeAntigen AFL2FSC双标样品双标样品LaserLogfluorescence(green)Logfluorescence(red)A+(%)B+(%)A+B+(%)neg.(%)FSCFL1FL2HistogramDotPlotContourPlotPseudo3-dimensionPlot3-dimensionPlotUnimodalorbimodal道数（道数（chann
5、elchannel）荧光强度坐标不等距荧光强度坐标不等距“Particle”can be used as a more general term for any of the objects flowing through a flow cytometer.“Event”is anything that has been interpreted by the instrument,to be a single particle,correctly or incorrectly.Each measurement from each detector is referred to as a“par
6、ameter”.Data are stored in so-called flow cytometry standard(FCS)format.Data stored on one cytometer may not be analyzable on software from another cytometer.细胞分选细胞分选分选纯度分选纯度分选产率分选产率厂家、型号、激光器、滤光片、软件厂家、型号、激光器、滤光片、软件Becton Dickinson(Maxwell W.Becton and Fairleigh S.Dickinson BD)：FACS“FluorescenceActiv
7、atedCellSorter”FACS I,II,III,IV,400,420,440,FACStar,Vantage,DiVa,Aria:Sorters.FACS Analyser,can,Calibur*,LSR,Canto:Benchtop.OtherManufacturers:Partec,Ortho(Cytofluorograph,Cytoron),Skatron,Partec,Dako(Galaxy),Cytomation(MoFlo).July 2002:DakoCytomation:Cyan benchtop.460 500 540460 500 540460 500 540S
8、P 500LP 500BP500/50Long passShort passBand pass滤光片滤光片二、二、在不同领域的应用在不同领域的应用细胞周期分析细胞周期分析细胞功能分析细胞功能分析细胞凋亡分析细胞凋亡分析免疫学领域免疫学领域其他领域其他领域（一）细胞周期分析（一）细胞周期分析G0/G1SG2/MPI#of Events0 200 400 600 8001000PIAneuploid peakAneuploid peakDNA index 1.21DNA index 1.21Cellular DNA content必须用必须用RNaseRNase去除去除RNARNADNA合成合成-
9、BrdUIncorporation凋亡细胞凋亡细胞BrdU+或或 S期细胞期细胞G0/G1期细胞期细胞G2/M期细胞期细胞增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）:参与参与DNA复复制和核酸的切补修复（制和核酸的切补修复（excisionrepair）的一种蛋白）的一种蛋白增殖相关抗原（增殖相关抗原（proliferationrelatedantigen）：）：Ki-67，Ki-S1细胞周期蛋白：细胞周期蛋白：CyclinD1,E,A,B1（二）细胞功能分析（二）细胞功能分析细胞活性分析细胞活性分析细胞膜电位细胞膜电位线粒体膜电
10、位、膜蛋白抗原线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A67A6细胞内细胞内CaCaCaCa2+2+2+2+胞浆内胞浆内pHpH活性氧（活性氧（ROSROS）1、细胞活性分析、细胞活性分析根据对细胞膜的渗透性不根据对细胞膜的渗透性不同来区分活同来区分活/死死/凋亡细胞：凋亡细胞：PI，EB，7-AAD and Hoechst 33342 2、细胞膜电位、细胞膜电位 由于细胞膜上各种泵的由于细胞膜上各种泵的作用，如钠钾泵、钙泵作用，如钠钾泵、钙泵等，使细胞膜内外维持等，使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度，着不同离子的浓度梯度，造成细胞膜电位造成细胞膜电位3、线粒体膜电位（、线粒体膜电位（MMP）线粒体在呼吸
11、氧化过程中，将所线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜。线粒体内膜。JC-1可进入细胞内，可进入细胞内，特异地与线粒体内膜结合，其特异地与线粒体内膜结合，其聚聚集程度随集程度随MMP升高而增加升高而增加。绿光，绿光，monomer形式存在形式存在膜电位下降（膜电位下降（100mV）时）时橘红色，橘红色，J-aggregates形式存在形式存在膜电位升高膜电位升高4、线粒体膜蛋白抗原、线粒体膜蛋白抗原7A6（38kDa）凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色5、细胞内、细胞内
12、Ca2+浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。6、胞浆内胞浆内pHv活细胞内活细胞内pHpH变化范围变化范围较小。较小。v某些生物学过程，如某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现号的应答，会出现pHipHi的变化。的变化。v增殖细胞比静止期细增殖细胞比静止期细胞偏碱性。胞偏碱性。7、活性氧（、活性氧（ROS）参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过
13、程。DCFH-DA本身没有荧光，在细胞内转化成本身没有荧光，在细胞内转化成DCFH。在。在ROS作用下，作用下，氧化为绿色荧光物质氧化为绿色荧光物质DCF。其荧光强度与细胞内。其荧光强度与细胞内ROS水平成正比。水平成正比。（三）细胞凋亡分析（三）细胞凋亡分析1 1、散射光信号的变化、散射光信号的变化 2.DNA含量含量PI-Fluorescence#EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells3、磷脂酰丝氨酸外翻磷脂酰丝氨酸外翻（Phospholipidredistribution）4、Caspases-3的激活的激活凋亡晚期，核酸内切酶活化，双链凋亡晚期，
14、核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称断裂点，产生一系会出现许多不对称断裂点，产生一系列的列的3末端。末端。TdT酶能够催化外源性荧光素酶能够催化外源性荧光素-dUTP连接到连接到DNA的的3末端。末端。尽管坏死细胞的细胞核尽管坏死细胞的细胞核DNA 也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所产生的末端较难与荧光素产生的末端较难与荧光素-dUTP结合。因而，坏死的细胞进行结合。因而，坏死的细胞进行TUNEL反应观反应观察不到荧光。察不到荧光。5.TUNEL6.p53 53 kDa的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着细胞在的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着
15、细胞在DNA损损伤无法修复时启动细胞的伤无法修复时启动细胞的“自杀自杀”过程。过程。P53突变或缺失是多种肿突变或缺失是多种肿瘤发生的重要原因。瘤发生的重要原因。（四）在免疫学领域的应用（四）在免疫学领域的应用NK细胞中有细胞中有CD8+细胞细胞;少量的单核细胞也能表达少量的单核细胞也能表达CD4;结合结合淋巴细胞绝对数淋巴细胞绝对数来看待某一亚群百分比的改变来看待某一亚群百分比的改变。WBC（CD45+）CD3+TlymphocyteCD19+BlymphocyteCD16+56+NKThelper/Tinducer（CD3+CD4+）Tsuppressor（CD28-）CD8+TTcyto
16、toxic（CD28+）1 1、淋巴细胞亚群分析、淋巴细胞亚群分析评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等68%CD8dim3.6%CD8dim10%6.7%Nave/MemoryTlymphocyte刚刚从从胸胸腺腺移移出出到到外外周周循循环环的的Naive细细胞胞，首首次次遇遇到到抗抗原原时时，增增殖反应强，产生细胞因子能力弱。殖反应强，产生细胞因子能力弱。当当Memory细细胞胞遇遇到到同同类类抗抗原原时时，产产生生大大量量的的细细胞胞因因子子，而而不是增殖反应。不是增殖反应。Naive T细胞高表达细胞高表达CD45RAhi、CD62Lhi。Me
17、mory T细胞表达细胞表达CD45RO，一般不表达，一般不表达CD45RA从从Naive向向Memory细细胞胞转转化化过过程程中中，CD11a表表达达增增加加、CD62L（L-selectin）表达丢失。）表达丢失。Th1/Th2lymphocyte T细胞根据其分泌的细胞根据其分泌的细胞因子细胞因子分为两型。分为两型。Th1类类细细胞胞分分泌泌IL-2,IFN-和和TNF-，参参与与细细胞胞免免疫疫，对抗胞内病原体，如病毒；对抗胞内病原体，如病毒；Th2类类细细胞胞分分泌泌IL-4、IL-5、IL-10与与IL-13,参参与与体体液液免免疫，对抗胞外感染，如寄生虫。疫，对抗胞外感染，如寄
18、生虫。Mousechicken chicken（42d 42d）chicken chicken（42d 42d）2 2、细胞表面活化抗原的表达、细胞表面活化抗原的表达3 3、细胞因子分析、细胞因子分析CBA（CytometricBeadsAssay）分析液体样本中可溶性成分）分析液体样本中可溶性成分用用一系列荧光强度不同的微球一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。同时分析样本中多种可溶性成分。每种微球大小一致，分别每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体包被有适合于特定分析的特异性抗体。所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（所有分析只需一组标准曲线，检测的线
19、性范围宽（0-5000 pg/ml）captureAbFluroescentdetectionAb Scatter gate on singletsR1IL2IL4IL5IL10TNFIFN Index Beads in FL3-Read signals in FL20208031362512505000standardcurves generated by CBA SoftwareHumanTh1/Th2CytokineCBA0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg0 pg20 pg20 pg80 pg80 pg312 pg312 pg1250 pg1250
20、pg5000 pg5000 pg40 pg40 pg156 pg156 pg625 pg625 pg2500 pg2500 pgIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-aIFN-g细胞膜表面的细胞因子分析细胞膜表面的细胞因子分析将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内CESEstaining cell protein4 4、细胞分裂、细胞分裂PKHlipophilic(亲脂性亲脂性)dyethatinsertsintothelipidbilayeroftheoutermembrane.通过分析，可以计算分化前体频率通过分析，可以计算分化前体频率（precursor f
21、requency）评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTLCTL介导的裂解功能的抑制。介导的裂解功能的抑制。5、CTL功能分析功能分析FluorogenicCaspaseSubstrates检测检测CTL介导的靶细胞凋亡介导的靶细胞凋亡proteolytic cleavage sites for individual caspases18-amino-acid peptidesfluorophoreIn the uncleaved substrates,fluorescence is quenched owing to the fo
22、rmation of intramolecular excitonic dimers.On cleavage of the peptides by specific caspases,the fluorophorefluorophore interaction is abolished,leading to an increase in fluoresence.TargetCelleffector cellsSpecific killing只要合成各种特异性只要合成各种特异性抗原，即可定量体内抗原，即可定量体内抗原特异性抗原特异性CTL。6、抗原特异性抗原特异性T T淋巴细胞的分析淋巴细胞的分
23、析其他领域的应用其他领域的应用具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）细菌的细菌的大小、质量、核苷酸和蛋白含量大小、质量、核苷酸和蛋白含量等大约是哺乳动物细等大约是哺乳动物细胞的胞的1/1000。信号强度低，限制了检测的精确度。信号强度低，限制了检测的精确度。细菌吸收和排除染料、药物等受细菌吸收和排除染料、药物等受细胞壁结构和孔、泵细胞壁结构和孔、泵的影响。的影响。肽聚糖外膜G+G肽聚糖细菌细胞细菌细胞壁的结构壁的结构G+G+：一般不需要额外的处理一般不需要额
24、外的处理，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：WalbergWalberg等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。G-G-：细胞膜排斥多数：细胞膜排斥多数亲脂性或疏水分子亲脂性或疏水分子，如，如cyaninecyanine染料。染料。EDTAEDTA等破膜后，可等破膜后，可使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。X4550，X4550(pVAX1-trc-DsRed)，X4550(p3334-DsRed),X6212(p333
25、4-DsRed)，Xa(pVAX1-trc-DsRed)DsRed在不同重组菌中的表达在不同重组菌中的表达体外细菌感染效率体外细菌感染效率病毒感染细胞的检测病毒感染细胞的检测流式分子表型流式分子表型（Molecularphenotyping）FCM-PCR-FISH：细胞中细胞中HIV特异性特异性DNA或或RNA如：测定端粒长度如：测定端粒长度三、三、样品及其前处理样品及其前处理颗粒：细胞颗粒：细胞单细胞悬液，避免任何细胞沉积单细胞悬液，避免任何细胞沉积荧光标记荧光标记仪器的限制：激光器、滤光片仪器的限制：激光器、滤光片-荧光素荧光素实验的限制：荧光素组合实验的限制：荧光素组合总的要求总的要求
26、1、细胞大小、细胞大小Injector Tip所有的细胞均需要经过过滤：所有的细胞均需要经过过滤：200200（75m75m）-300-300（45m 45m）-400-400（37m37m）目）目喷嘴：喷嘴：7070和和100m100m2、细胞物理参数的变化、细胞物理参数的变化不同的处理和固定方法也可能造成不同的处理和固定方法也可能造成FSCFSC信号的改变。另外，非球形细胞信号的改变。另外，非球形细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞的的FSCFSC信号完全不同。信号完全不同。在可能的情况下，尽量用荧
27、光参数来设门。在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。3 3、设门、设门v散射光设门：注意细散射光设门：注意细胞形态的变化胞形态的变化v荧光设门：要明显区分荧光设门：要明显区分阴、阳性细胞阴、阳性细胞500600700800Wavelength nmIntensityFITCFITCFITCPEPEECDECDPC5PC5APCAPCPC7PC74、荧光补偿、荧光补偿需要用单标样品来调节荧光补偿需要用单标样品来调节荧光补偿5 5、红细胞的影响、红细胞的影响v溶血：不影响表溶血：不影响表面抗原的标记，面抗原的标记，常用标记后溶血常用标记后溶血6 6、洗涤效果、洗涤效果7 7、标记效果、标记效果胞内
28、抗原（胞内抗原（ICIC：同型对照）：同型对照）表面抗原（标记荧光和自发荧光）表面抗原（标记荧光和自发荧光）改变抗体的量是改变抗体的量是改变浓度而不是改变浓度而不是体积体积less than or equal to 0.5g per million cells in a 100vl total staining volume避光标记避光标记同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。同一实验尽量用同厂家、同批次高质量抗体。按照说明，标记试剂一般不能冻存按照说明，标记试剂一般不能冻存慎用未经慎用未经FCM鉴定的抗体鉴定的抗体首选直标，间标有时效果不好首选直标，间标有时效果不好8 8、实验对照的设计、
29、实验对照的设计空白对照空白对照阴性对照：常用同型对照阴性对照：常用同型对照 单色分析：同型对照单色分析：同型对照 多色分析：同型对照、单阳性对照多色分析：同型对照、单阳性对照 同型对照同型对照：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。生的背景染色。阳性对照：检测阴性时阳性对照：检测阴性时FcFc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgGIgG。9 9、细胞数量、细胞数量统计学意义统计学意义计数：计
30、数：10106 6数量级数量级/0.1-0.5ml/0.1-0.5ml非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞需要分析的细胞至少要大于需要分析的细胞至少要大于500500个。个。DNADNA分析的样品要大于分析的样品要大于1000010000个。个。FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFluorescent IntensityNumber of Events荧光强度与结合位点数量成正比（可用荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度百分数和荧光强度表示）表示）10、单个细胞成分的定量、单个细胞成分的
31、定量DCFHDCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示）染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示）11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在在同一次实验过程中完成同一次实验过程中完成。CMF-DACMF-DA标记检测细胞内酶的活性标记检测细胞内酶的活性 1212、检测速度、检测速度通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。默认为一个细胞默认为一个细胞荧光强度升高荧光强度升高对于细微差别的比较，结果影响较大对于
32、细微差别的比较，结果影响较大DNADNA样品可用双联体辨别模式（样品可用双联体辨别模式（DDMDDM）区分）区分1313、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少 LaserLaserTimeVoltageHighestTimeVoltageLaserLaserLowerTimeVoltageLaserLaserLower根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号1414、细胞的活性、细胞的活性v抗凝剂：肝素抗凝剂：肝素 避免使用络合钙的抗凝剂，如避免使用络合钙的抗凝剂，如ACDACD与与EDTAE
33、DTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。因为它们会限制钙依赖性激活过程。vPIPI排除死细胞排除死细胞1515、弱表达抗原常选用、弱表达抗原常选用PEPE标记标记CD8:PerCP APC FITC ECD PC5 PE1616、胞内染色、胞内染色胞膜和胞内同时表达的抗原胞膜和胞内同时表达的抗原:分别作表面和胞浆内染色分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。染色可能会使表面抗原丢失或
34、改变。固定固定：蛋白的交联和变性蛋白的交联和变性。破膜：细胞膜穿孔。破膜：细胞膜穿孔。1 1皂甙皂甙同时测定表面、胞内同时测定表面、胞内AgAg和和DNADNA含量含量：膜膜胞内胞内DNADNA。膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进入胞内。素分子足够小，能进入胞内。1717、DNADNA分析分析RNARNA酶处理前后的比较酶处理前后的比较1818、酵母菌的自发荧光、酵母菌的自发荧光1919、细胞分选、细胞分选鞘液的高压蒸汽消毒鞘液的高压蒸汽消毒地面、桌面的清洁消毒地面、桌面的清洁消毒室内紫外消毒室内紫外消毒仪器管
35、道的清洗仪器管道的清洗AccudropAccudrop beads beads影响分选结果的因素影响分选结果的因素仪器状态仪器状态样品：样品：标记抗原、洗涤、过滤标记抗原、洗涤、过滤保持细胞活性：保持细胞活性：小牛血清小牛血清不同的抗原标志可能会影响分选纯度不同的抗原标志可能会影响分选纯度分选后的分选后的CD133+细胞多次洗涤后，荧光强度明显下降细胞多次洗涤后，荧光强度明显下降检测过程中遇到的几个问题检测过程中遇到的几个问题v测试目的一定要清楚，特别是代替他人测试时：测试目的一定要清楚，特别是代替他人测试时：比如，比如，PI标记分析细胞周期、细胞活性或者细标记分析细胞周期、细胞活性或者细胞凋亡；胞凋亡；v在检测未染色对照时，需要事先了解多色标记在检测未染色对照时，需要事先了解多色标记所用的荧光素组合。所用的荧光素组合。Tetramer分析分析HLA-A2051487979383 821/826