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1、实验专题模块三实验专题模块三 血液生化检验血液生化检验p血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳p血清尿素氮的测定血清尿素氮的测定p血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液约占体重的十三分之一，相对密度为1.0501.060，pH值为7.37.4，渗透压为313 mmol/L。p血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。p利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量，叫做血生化检查。p在正常生理情况下，其各种化学成
2、分的含量非常恒定。但是，机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。p本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测，使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。实验一实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的一、实验目的1.掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义。2.了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的操作。二、背景与原理二、背景与原理血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各有差异。所以在电场作用下，可在醋
3、酸纤维薄膜上分离成A、1、2、和五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别用剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定，最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百分数。+白蛋白白蛋白(A)12 血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、1、2、和五条区带。蛋白名称蛋白名称等等电电点点分子量分子量白蛋白4.88690005.061：200002：3000
4、05.1290000-1500006.85-7.50156000-300000p醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。p醋酸纤维素薄膜经1,4二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性四、四、实验操作实验操作1.准备与点样：1）将薄膜切成2.58cm的小块，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样位置。2）将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（缓冲液盛于培养皿中），使
5、膜条自然浸湿下沉。3）将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上，使点样线空架。4）用血色素吸管吸取人新鲜血清35ul，涂于宽2厘米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。2.电泳:将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.40.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。3.染色:通电完毕后用镊子将膜取
6、出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。4.定量：取试管6支，编好号码，分别用吸管吸取0.4N氢氧化钠4ml。剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白、1、2、球蛋白各管的吸光度值A。5.计算:光吸收总和A总AA+A1+A2+A+A各部分蛋白质的百分数为：白蛋白%=(AA/A总)100%;1球蛋白%=(A1/A总)100%;
7、2球蛋白%=(A2/A总)100%；球蛋白%=(A/A总)100%；球蛋白%=(A /A总)100%临床意义p正常值：白蛋白：5772%1球蛋白：25%2球蛋白：49%球蛋白：6.512%球蛋白：1220%p急性肝炎：发病早期蛋白质电泳无变化，发病两周后白蛋白、2及球蛋白减少，球蛋白增高。p慢性肝炎：球蛋白升高，白蛋白下降较急性肝炎显著。p肝硬化：白蛋白、1、2球蛋白均明显下降，球蛋白极度升高，甚至A/G比值倒置。p肾病综合征时，白蛋白降低，2、球蛋白升高。实验二实验二 血清尿素氮的测定血清尿素氮的测定一、实验目的一、实验目的1.掌握血尿素氮的定义及其测定的意义。2.了解二乙酰一肟显色法的原理
8、与操作。二、背景与原理尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。通常肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，因此在血液中会有少量的尿素存在，一般用血尿素氮（BUN）来衡量。肾小管内尿流速越快，尿素的重吸收就越少，也即达到了最大清除率。如果肾功能出现了损害，则有可能导致尿素排出减少，或者是重吸收增多，使得BUN升高。和血肌酐（SCR）一样，在肾功能损害早期，血尿素氮可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时，血尿素氮的浓度才迅速升高。正常情况下，血尿素氮与肌酐之比（BUN/Scr）值约为10.1，高蛋白饮食、高分解代谢状态、缺水、肾缺血、血容量不足及某些急性肾小球肾炎，
9、均可使比值增高，甚至可达2030；而低蛋白饮食，肝疾病常使比值降低，此时可称为低氮质血症。血尿素氮的检测方法有很多，在本实验中我们将使用二乙酰一肟显色法。该方法的原理是，尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素的含量成正比，可通过分过光度法获得尿素含量。因二乙酰不稳定，故用二乙酰一肟来代替。二乙酰一肟与强酸作用，可产生二乙酰，进而再与尿素反应，过程如下：反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以须用氧化剂将其氧化除去，可用的氧化剂有过硫酸盐、砷酸、过氯酸、氯胺T以及一些阳离子等。另外，在显色反应中产生的复合物存在着对光不稳定的问题。加入硫氨脲既能提高尿素与二乙酰反
10、应的灵敏度，又能增加其显色的稳定性。硫氨脲如果结合三价铁离子或镉离子一起使用更能提高灵敏度。这样就可以进不除血清蛋白的超微量尿素氮测定。四、实验操作四、实验操作试试管管编编号号1234尿素氮标准液（ml）1234蒸馏水（ml）5432尿素氮的浓度（mg/100ml）10203040系列标准溶液的配制测定液的配制试管编号试管编号123456蒸馏水（L）0000200分别从上表1-4管吸取液体加入对应编号管（L）2020202000血清样品（L）20酸性试剂（mL）5555552%二乙酰一肟（mL）0.50.50.50.50.50.5混匀后置于沸水中水浴12分钟。置冷水中冷却5分钟后，用540nm
11、进行比色，以5号管作为空白，读取各管光吸收读数。将所得读数作纵座标与相应尿素氮浓度作横坐标在座标纸上作图，绘成标准曲线查标准曲线，得待测血清中尿素氮含量。五、注意事项五、注意事项1.如血浆或血清尿素氮浓度超过40mg时，则必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结果乘稀释倍数即可。六、临床意义六、临床意义1.正常值范围：519mg/100ml2.可能临床提示：1）血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。A生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.30.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生理变异平均为0.63mmol/L。B病理因素a.肾
12、前性：最重要的原因是失水，因血液浓缩使肾血流量减少，肾小球滤过率减低而致血液尿素浓度增加。b.肾性：肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎等影响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。c.肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。2）血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外，常见于肝功能衰竭患者。课堂分组讨论课堂分组讨论患者女性，47岁，农民。因反复发作性昏迷半年，近发作7小时入院。体检：中度昏迷，肝未触及，无瘫痪体征。心电监测以及头颅CT均未发现明显异常。立即使用甘露醇静脉滴注，3小时后患者苏醒。追问病史，患者来自血吸虫病区，3年前因脾脏肿大行脾切除术。每次昏迷前均有进食高蛋白食物史，但未引起重视。本次发病前在亲戚家进食鸡蛋两个，烤鸭约半斤以及少量猪肉。肝功能检查：血氨150umol/L，血清白蛋白38.2g/L，球蛋白27.4g/L，总胆红素15.2umol/L,ALT 135U/L,AST 45U/L.。B超显示，血吸虫性肝纤维化。问题讨论：1.患者高蛋白饮食与肝性脑病发病的关系如何？2.肝性脑病的分子机制。