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1、一、基因芯片（一、基因芯片（gene chip）技简介）技简介生物芯片（生物芯片（biochip）基因芯片（基因芯片（gene chip,DNA chip,or DNA microarry）基本概念基本概念GeneChip主主要要是是用用Northern blotting的的原原理理，将将Northern Blotting的的探探针针固固定定在在特特定定的的固固体体基基质质上上，而而原原来来印印记记在在膜膜上上的的目目标标RNA进进行行标标记记，然然后进行的大规模的杂交。后进行的大规模的杂交。The Dimensions of a GeneChip5”5”5”5”Up to 6,500,000
2、 Up to 6,500,000 featuresfeatures /chipchip1.28cm1.28cm1.28cm1.28cm5m5m5m 5m *Millions of identical Millions of identical probesprobes /featurefeature基因芯片的制作方法基因芯片的制作方法原位合成芯片原位合成芯片 光蚀刻原位合成法（Affymetrix）、电化学原位合成法、喷墨式原位合成法点样芯片点样芯片 针点式点样法、喷墨式点样法 原位光刻合成基因芯片原理原位光刻合成基因芯片原理光源遮蔽板芯片array probesA 33 arrayCGACG
3、ACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探针合成探针合成探针合成探针合成array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAAA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探针合成探针合成完成的芯片完成的芯片Cy3和Cy5Cy3激发
4、波长532nmCy5激发波长635nm表达谱芯片实验流程1、分离RNA（10g）2、标记3、杂交（预杂交）4、洗片5、扫描Affymetrix GeneChip 二、第二代测序技术简介二、第二代测序技术简介（Next-generation sequencing）Key Genomics Technologiesl l19751975-Southern DNA hybridization technique-Southern DNA hybridization techniquel l19771977-Sangers chain-termination and -Sangers chain-te
5、rmination and MaxamMaxam、Gilberts chemical DNA sequencing methodsGilberts chemical DNA sequencing methodsl l19801980-Automated -Automated in situin situ oligonucleotideoligonucleotide synthesis synthesis instrumentinstrumentl l19851985-Mulliss discovery of PCR at -Mulliss discovery of PCR at CetusCe
6、tusl l1992-1992-AffymetrixAffymetrix(Fodors group)first gene-chip(Fodors group)first gene-chipl l1995-1995-ABIsABIs first automated DNA sequencer first automated DNA sequencerl l2006-22006-2ndnd generation DNA sequencer on market generation DNA sequencer on marketl l2007 and beyond Single molecule s
7、equencing 2007 and beyond Single molecule sequencing techniquestechniques测序技术的发展测序技术的发展双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法(Sanger 测序法测序法)1970s 同位素标记，手工同位素标记，手工1980s 荧光标记，自动荧光标记，自动1990s 毛细管电泳毛细管电泳合成测序法（第二代测序）合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）连接测序（连接测序（Seq
8、uencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）单分子测序技术（第三代测序）单分子测序技术（第三代测序）HelicosPacific BiosciencesOxford Nanopore 14厂商厂商RocheIlluminaABI技技术454Solexa GASOLiD测序序仪GS20FLXTiIIIIIx123序列数目（百万）序列数目（百万）0.50.51.252810025040115320单末端末端测序（序（Single-end）读长（bp）1002004003550100253550运行运行时间（天）（天）0.250.30.4335658通量（通量（Gb）0.050.10
9、.515251416配配对末端末端测序（序（Paired-end）读长（bp）2004002352502100225235250库序列序列长度（度（kb）3.53.50.20.20.2332运行运行时间（天）（天）0.30.461010121016通量（通量（Gb）0.10.529502832SolexaSolexa和和SOLiDSOLiD配配对对末端末端测测序所需序所需时间时间和和产产出是出是单单末端的两倍，末端的两倍，454454的配的配对对末端和末端和单单末端末端差异在于建差异在于建库库方法，所需方法，所需时间时间和和测测序量不序量不变变。ABI SOLiDABI SOLiD包含两包含两
10、张张芯片，芯片，这这里的数据是一里的数据是一张张芯片的量。芯片的量。表表1.1 目前使用最广泛的三大第二代目前使用最广泛的三大第二代测测序平台序平台测测序能力序能力统计统计信息（信息（2010年年初数据）年年初数据）http:/3个水稻基因组/天 12个水稻基因组/天 10个水稻基因组/天 19941994：3 3亿美元测定一个人类基因组亿美元测定一个人类基因组(1:10)(1:10)19841984：30 30亿美元测定一个人类基因组亿美元测定一个人类基因组未来目标：未来目标：1000/100 1000/100 美元测定一个人类基因组美元测定一个人类基因组20042004：3 3千万美元测定
11、一个人类基因组千万美元测定一个人类基因组(1:100)(1:100)20062006：1 1百百5050万美元测定一个人类基因组万美元测定一个人类基因组(1:2000)(1:2000)20082008：5050万美元测定一个人类基因组万美元测定一个人类基因组(1:6000)(1:6000)Solexa 测序技术原理介绍测序技术原理介绍（1）Solexa 测序技术原理介绍测序技术原理介绍（2）Solexa 测序技术原理介绍测序技术原理介绍（3）Solexa 测序技术原理介绍测序技术原理介绍（4）Paired End ReadsFrom Shendure et alRead 1Read 2Know
12、n DistanceJumping Library ContructionFragments熊猫基因组测序使用熊猫基因组测序使用10 kb、5 kb、2 kb片段分别建库测序片段分别建库测序TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGGRTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNMme I site:Paired End Reads are Important!Repetitive DNAUnique DNASingle read maps to multiple positionsPaired read maps uniquelyRead 1Read 2Known Distan
13、ceShendure et al 2005Solexa测序技术的特点边合成边测序（sequencing by synthesis,SBS）大规模平行化（massively parrellel）新的测序技术会对生物科学的研究产生深远的影响，它会新的测序技术会对生物科学的研究产生深远的影响，它会产生海量的数据。产生海量的数据。纯粹依靠靠生物化学或者分子生物学技纯粹依靠靠生物化学或者分子生物学技术的实验室将会很难生存术的实验室将会很难生存!只懂生物化学和分子生物学的生物学家只懂生物化学和分子生物学的生物学家将会很难生存！将会很难生存！每个学生物的学生都应该掌握生物信息每个学生物的学生都应该掌握生物信息学和统计学！学和统计学！