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1、生物技术综合实验 实验三实验三 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定）的提取及活性测定 一、目的和要求 通过植物材料（玉米）超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋白质的方法和原理。二、实验原理超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于植物体内，它是一种重要的自由基清除剂，对生物体有多种保护作用。超滤是一种蛋白质浓缩方法，只要选择适当的滤膜可将玉米浆中的SOD与其他小分子杂蛋白、可溶性糖等分离。三、材料与试剂1.1.材料材料 玉米籽粒玉米籽粒2.2.主要试剂主要试剂1 1、0.05mol/L0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.8p
2、H7.8）,500mL,500mL 2 2、氯仿、氯仿-乙醇混合液：氯仿乙醇混合液：氯仿:无水乙醇无水乙醇=3:5=3:5 3 3、丙酮：用前需预冷至、丙酮：用前需预冷至4-104-104 4、0.05mol/L0.05mol/L碳酸盐缓冲液（碳酸盐缓冲液（pH10.2pH10.2）5 5、0.1mol/LEDTA0.1mol/LEDTA溶液溶液2.3 仪器恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒，等。四、操作步骤4.1 SOD粗提液的制备1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣或玉米种子，置于研钵中研磨。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L
3、磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60热处理15min，得到SOD酶液。3.2 SOD活性测定试剂（mL）空白对照管 样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0EDTA溶液 0.5 0.5蒸馏水 0.5 样品液 0.5混合均匀，在30水浴中预热5min，测定OD4803.3 结果计算 总酶活力=酶液总体积X稀释倍数/抑制50%的酶液量X样品重五、本实验教学内容的重点和难点重点：粗提液的获得玉米SOD的提取难点：提取条件的控制六、本实验教学内的深化和拓展 通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物SODSOD与动物与动物SODSOD的区别，了解植物的区别，了解植物SODSOD的优势。的优势。七、思考题，完成实验报告1 什么是分段盐析，为什么要分段盐析？2 SOD有哪些用途？