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1、一、相关概念一、相关概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体二、基本原理及操作步骤二、基本原理及操作步骤 本节主要内容本节主要内容第1页/共64页一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖。无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆第2页/共64页DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复
2、复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称基因克隆或重组称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。第3页/共64页生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。目的目的 分离获得某一目的基因或分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(g
3、enetic engineering)实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组重组DNA技术。技术。第4页/共64页（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶第5页/共64页重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形
4、成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进
5、行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第6页/共64页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)识别识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H第7页/共64页
6、作用：作用：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保保护护自自身身DNA。分类：分类：、类类（基因工程技术中常用的是基因工程技术中常用的是类类）第8页/共64页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序H Haemophilus aemophilus ininfluenzae
7、 fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶第9页/共64页类酶识别序列特点：类酶识别序列特点：回文结构回文结构(palindrome)切口：切口：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG第10页/共64页Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口第11页/共64页有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末
8、端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍伍未未端端(compatible end)。Bam Bam H HBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A第12页/共64页DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶连接酶DNA连接酶催化连接酶催化5和和3端形成磷酸二酯键，端形成磷酸二酯键，底物为带缺口的底物为带缺口的DNA、黏端、黏端DNA或平端或平端DNA。GGATCTCCTAGAGCCTAGGATCT A+Bam H第13页/共64页（三）目的基因（三）目的基因 cDNA(
9、complementary DNA)：为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA 基因组基因组DNA(genomic DNA)第14页/共64页（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA第15页/共64页克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意设计的载体称为意设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expressi
10、on vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。第16页/共64页载体的选择标准载体的选择标准含有复制起始点，能在宿主中独立复制；含有复制起始点，能在宿主中独立复制；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA；不能插入宿主基因组，易于分离和纯化；不能插入宿主基因组，易于分离和纯化；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），由限制性内切酶插入点），由限制性内切酶的识别序
11、列组成。的识别序列组成。第17页/共64页1.质粒质粒(plasmid)特点特点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传传信信息息,会会赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些些遗遗传传性性状状（一一般般带带有抗生素的抗性基因）。有抗生素的抗性基因）。细菌染色体外细菌染色体外的小型环状双链的小型环状双链DNADNA分子。分子。第18页/共64页第19页/共64页第20页/共64页噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phag
12、e)：适用于大：适用于大片段片段DNA的克隆的克隆M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列第21页/共64页3.柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱的物理图谱第22页/共64页酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体杆状病毒载体其他其他第23页/共64页二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNA导入受体菌导入受体菌外源基因
13、与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第24页/共64页 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第25页/共64页（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)第
14、26页/共64页1.化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列第27页/共64页组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌存在于转化细菌内存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2.基因组基因组DNA文库文库第28页/共64页限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染
15、色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库第29页/共64页mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.3.cDNAcDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T第30页/共64页D
16、NA序列是已知的，或两端已知，可以利序列是已知的，或两端已知，可以利用选择性体外扩增用选择性体外扩增DNA的方法的方法PCR。是一种在体外利用酶促反应大量获得特异是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组序列的基因组DNA或或cDNA的专门技术，又称的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。为无细胞的分子克隆。4.聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）第31页/共64页模板模板DNA引物引物4种种dNTPTaq DNA聚合酶聚合酶含含Mg2+的缓冲液。的缓冲液。PCR的反应体系的反应体系第32页/共64页（1）变性变性，加热至，加热至95，使模板，使模板DNA解开成单解开成单链；链；（2）退火退
17、火，温度降至适宜，使引物与模板互补结，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；合；（3）延伸延伸，温度升至，温度升至72 ，DNA聚合酶以聚合酶以4种种dNTP为底物，在引物的为底物，在引物的3-OH上，合成与模上，合成与模板互补的板互补的DNA新链。新链。PCR的基本反应步骤及原理的基本反应步骤及原理第33页/共64页PCR反应条件反应条件变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CTm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度 第34页/共64页PCR反应的基本原理反应的基本原理第35页/共64页（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1
18、)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建第36页/共64页Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接第37页/共64页不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg
19、l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。第38页/共64页2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端第39页/共64页目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第40页/共64页3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用
20、下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第41页/共64页5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体第42页/共64页4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上带
21、有新的酶切位点的接头，由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。端连接。第43页/共64页Eco REco REco R人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R第44页/共64页受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式导入方式转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌第45页/共6
22、4页（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等第46页/共64页(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择第47页/共64页组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNA重组体重组体标标志志补补救救第48页/共64页 互互
23、补补的的检检测测第49页/共64页重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 第50页/共64页重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主
24、带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第51页/共64页表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达第52页/共64页1.原核表达体系原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白
25、质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白第53页/共64页优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、费钱操作技术难、费时、费钱转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞酵
26、母、昆虫、哺乳类动物细胞第54页/共64页表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱第55页/共64页第56页/共64页（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药第57页/共64页 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激
27、白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍
28、乱预防霍乱第58页/共64页基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失或插入等突变。失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断第59页/共64页标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自
29、动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。第60页/共64页（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)第61页/共64页1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防第62页/共64页复习思考题：复习思考题：1.1.概念：概念：（1 1）克隆）克隆（2 2）转化）转化（3 3）转位）转位（4 4）基因工程）基因工程（5 5）转座）转座（6 6）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶（7 7）载体）载体（8 8）质粒）质粒2.2.简述基因工程的基本过程。简述基因工程的基本过程。3.3.简述目的基因的主要来源或途径。简述目的基因的主要来源或途径。第63页/共64页感谢您的观看！第64页/共64页