第五章重组DNA技术.pptx

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1、第五章第五章 重组重组DNA技术技术以以LNX1基因的表达载体构建进行说明基因的表达载体构建进行说明第第 一一 节节 重组重组DNA技术的主要工技术的主要工具具一一 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结

2、构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能Taq酶酶用于用于PCRDNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合

3、酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或

4、标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第第 二二 节节 载体载体载体定义载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(express

5、ion vector)含含有有能能被被宿宿主主细细胞胞基基因因表表达达系系统统识识别别的的表表达达元元件件、从从而而可可以以在在宿宿主主细细胞胞内内表表达达目目的的基因合成目的蛋白的载体。基因合成目的蛋白的载体。载体的选择标准载体的选择标准复制的起始点，能自主复制；复制的起始点，能自主复制；选择标记，具有两个以上的遗传标记物，选择标记，具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外

6、源DNA。表达载体还要有表达元件。表达载体还要有表达元件。质粒质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。第第 二二 节节 重组重组DNA技术的基本原技术的基本原理理基本原理基本原理获取目的基因，选择载体获取目的基因，选择载体DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接切割目的基因和载体切割目的基因和载体重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程一一 目的基因的

7、获取目的基因的获取1.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)2.cDNA文库文库(cDNA library)3.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)4.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。三三 目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接二二 克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建1.平端连接平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因限

8、制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连2.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连不同限制酶切位点连接接 单酶切末端连接单酶切末端连接 双酶切末端连接双酶切末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因

9、自连目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5

10、335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶T(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTP4.4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用人工接头及其应用CC

11、GAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式导入方式 转化转化(transformation)：重组：重组DNA导入宿主导入宿主细胞的过程。细胞的过程。四四 重组重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞五五 筛选和鉴定重组体筛选和鉴定重组体 1.平板筛选平板筛选 2.酶切分析酶切分析 3.PCR分析分析 4.核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白

12、的克隆和检出重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA

13、 cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物第三节第三节 LNX1基因的表达载体构建基因的表达载体构建1、查找基因序列，根据基因序列设计、查找基因序列，根据基因序列设计PCR引物引物 1 tttcctggtc tggagcgacc aatgccgtcc tccttcctcc aggcacctgt tcaccgaagt 61 tgaggctggt cacaactccg gcggcccaag gagctgctcg gttcacccac aaggaatgag 121 agctgcctgc ctgctgctgc ttggagagcc ccagacagtc gcttgaagag gtgtgtggat 18

14、1 gtctcctaga tcttgacttg ctcctgagga aatattgtgt gactgagttt cctgttatac 241 tgctctccaa tccatcatga accagccaga gtctgccaac gatcctgaac ccctgtgtgc 301 agtgtgtggc caagcccact ccttggagga aaaccacttc tacagctatc cagaggaagt 361 ggatgatgac ctcatctgcc acatctgcct gcaggctttg ctggaccccc tggacactcc 421 gtgtggacac acctact

15、gca ccctctgcct caccaacttc ctggtggaga aggacttctg 481 tcccatggac cgcaagcctc tggttctgca gcactgcaag aagtccagca tcctggtcaa 541 caaactcctc aacaagctac tggtgacctg cccattcagg gagcactgca cccaggtgtt 601 gcagcgctgt gacctcgagc atcactttca aaccagctgt aaaggtgcct cccactacgg 661 cctgaccaaa gataggaaga ggcgctcaca agatg

16、gctgt ccagacggct gtgcgagcct 721 cacagccacg gctccctccc cagaggtttc tgcagctgcc accatctcct taatgacaga 781 cgagcctggc ctagacaacc ctgcctacgt gtcctcggca gaggacgggc agccagcaat 841 cagcccagtg gactctggcc ggagcaaccg aactagggca cggccctttg agagatccac 901 tattagaagc agatcattta aaaaaataaa tcgagctttg agtgttcttc gaa

17、ggacaaa 961 gagcgggagt gcagttgcca accatgccga ccagggcagg gaaaattctg aaaacaccac 1021 tgcccctgaa gtctttccaa ggttgtacca cctgattcca gatggtgaaa.Sal-LNX-FP-2445 GCGTCGACTCTCCAATCCATCATGAACCAG 3Sal-LNX-FP-13095 ATGTCGACGTGGCTGACTGTGATGCGTG 3Kpn-LNX-RP-24775 ATCCATGGGATTTTTCTGTTTTCCTCTGACCC 3Sal-短LNX-FP-2835

18、 ACGTCGACAAGGCAGCACACTGCTCGGAG 3Sal-短LNX-FP-2745 ACGTCGACGCCAGGGAGAAGGCAGCACAC 3Kpn-短LNX-RP-22405 ATCCATGGTGTGATTTTTCTGTTTTCCTCTGAC 3Sal-LNX-FP-2175 ACGTCGACGTGTGACTGAGTTTCCTGTTATACTG 3Sal-LNX-FP-2805 ACGTCGACCGATCCTGAACCCCTGTGTGC 3Kpn-LNX-RP-13275 ATCCATGGTTAACGCATCACAGTCAGCCACAGC 3 2、利用设计的、利用设计的PC

19、R引物和脑库引物和脑库cDNA模板进行模板进行PCR3、切胶回收、切胶回收PCR产物，与产物，与T载体进行连接载体进行连接T载体结构图载体结构图连接体系如下：连接体系如下：载体载体 0.5ulPCR回收产物回收产物 9.5ulSolution 10ul混匀后混匀后16水浴水浴24小时连接。小时连接。4、重组、重组T载体进行转化培养以得到大量重组质粒载体进行转化培养以得到大量重组质粒TOP10感受态的制备：感受态的制备：常规转化方法：常规转化方法：即从即从-80冰箱取出感受态冰箱取出感受态TOP10后，冰中解冻半后，冰中解冻半小时，然后加入质粒，混匀后冰中半小时，在小时，然后加入质粒，混匀后冰中

20、半小时，在42热激热激90秒，冰中放秒，冰中放5分钟，加入分钟，加入800ul 2YT液体培液体培养基培养养基培养20-30分钟，分钟，5000rpm离心离心3分钟，吸出分钟，吸出850ul上清后混匀沉淀再涂上清后混匀沉淀再涂Amp平板。平板。37培养箱培养箱中培养中培养12小时。小时。细菌培养和重组质粒的提取：细菌培养和重组质粒的提取：1、挑取、挑取Amp平板中的单个菌落，在平板中的单个菌落，在4ml 2YT液体液体培养基中培养。培养基中培养。2YT的配制：的配制：称取酵母粉称取酵母粉3g，蛋白胨，蛋白胨4.8g，NaCl 1.5g，溶解后定溶至，溶解后定溶至300ml，4ml每管分装后，每

21、管分装后，120灭菌灭菌35分钟即成。分钟即成。2、质粒提取：一般按试剂盒说明提取，包括离心、质粒提取：一般按试剂盒说明提取，包括离心沉淀细菌沉淀细菌含含RNA酶的缓冲液重新悬浮细菌酶的缓冲液重新悬浮细菌加碱加碱性裂解液裂解细菌性裂解液裂解细菌加中和液中和加中和液中和离心沉淀蛋白离心沉淀蛋白质等杂质质等杂质上清用柱子结合质粒上清用柱子结合质粒洗涤液洗涤洗涤液洗涤蒸蒸馏水洗脱质粒馏水洗脱质粒5、对重组质粒进行、对重组质粒进行PCR鉴定与酶切鉴定以及测序鉴定与酶切鉴定以及测序6、将对的重组质粒与表达载体进行双酶切、将对的重组质粒与表达载体进行双酶切7、回收酶切载体与克隆片段，并进行连接，再通过、回收酶切载体与克隆片段，并进行连接，再通过测序验证测序验证8、转化进入细胞检查表达情况、转化进入细胞检查表达情况