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1、基本要求基本要求 1 1掌掌握握本本类类药药物物质质量量检检验验的的基基本本程程序序与与方法类型。方法类型。2 2掌掌握握HPLCHPLC法法和和酶酶活活力力测测定定法法在在本本类类药药物测定中的应用。物测定中的应用。3 3熟熟悉悉本本类类药药物物的的范范围围、种种类类、质质量量控控制的要点。制的要点。4 4了解本类药物含量测定的其他方法。了解本类药物含量测定的其他方法。返 回第1页/共41页 一、防病、一、防病、治治 病的病的三大药三大药源源 第一节第一节 概概 述述第2页/共41页 1 1生化药物：生化药物：例例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。第3页/共41页2
2、.2.基因工程药物基因工程药物：以以DNADNA重组技术生产的蛋白质、多肽、重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。因子类药物。第4页/共41页DNADNA重组技术（基因工程）：重组技术（基因工程）：生产过程生产过程为为天然基因天然基因合成的核合成的核苷酸序列苷酸序列内切酶内切酶连接酶连接酶载载体体重组重组的遗的遗传物传物质质转转移移到到宿主宿主细胞细胞增殖、表达增殖、表达分离纯化分离纯化目的目的产物产物第5页/共41页二、种类二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类酶类与辅酶类多糖类多糖类脂质类脂
3、质类核酸及其降解物和衍生物核酸及其降解物和衍生物类药物类药物1 1生化药物生化药物第6页/共41页2 2基因工程药物的种类基因工程药物的种类 1 1）激素类及神经递质类药物：）激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子、人人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素胰岛素、人生长激素 2 2）细胞因子类药物：）细胞因子类药物：人干扰素人白细胞介素、集落人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素刺激因子、促红细胞生成素 3 3）酶类及凝血因子类药物）酶类及凝血因子类药物第7页/共41页 三、特点三、特点 1.1.生物体的基本生化成分生物体的基本生化成分 2.2.分子量大分子量大:分子
4、量测定分子量测定 3.3.结构难确证结构难确证 4.4.全过程的质量控制：原料、生产过程、全过程的质量控制：原料、生产过程、最终产品最终产品 5.5.生物活性检查生物活性检查第8页/共41页 6.6.安全性检查安全性检查 7.7.效价（含量）测定：效价（含量）测定：理化法理化法：有效成分的含量：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定效价测定和酶活力测定：有效成分：有效成分 的生物活性的生物活性返 回第9页/共41页 生化药物和基因药物质量控制的项目：生化药物和基因药物质量控制的项目：来源与种类来源与种类 纯度纯度 性状性状 干燥失重或干燥失重或水分水分 鉴别鉴别 炽灼残渣炽灼残渣 氨酸组分分析氨
5、酸组分分析 生物活性生物活性 肽图肽图 热源试验热源试验 糖含量糖含量 含量分析含量分析 第二节第二节 质量检验的基本程序与方法质量检验的基本程序与方法第10页/共41页一、鉴别一、鉴别 理化鉴别法：化学鉴别法理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度紫外分光光度法法 HPLCHPLC法法生化鉴别法：酶法生化鉴别法：酶法 电泳法电泳法 等电聚焦法等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验生物鉴别法：家兔惊厥试验第11页/共41页（一）理化鉴别法一）理化鉴别法 1.1.化学鉴别法化学鉴别法：例：溶菌酶例：溶菌酶 -CONH-+Cu-CONH-+Cu2+2+络合显色络合显色第12页/共41页 2.2.紫外分光光
6、度法紫外分光光度法 溶剂：溶剂：0.01mol/L0.01mol/L盐盐酸酸例：三磷酸腺苷二钠例：三磷酸腺苷二钠 浓度：浓度：20g/ml20g/ml 判断：判断：maxmax：2571nm2571nm A A250250/A/A260260：0.170.170.270.27。3.3.HPLCHPLC法：法：利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。时间和肽图谱的一致性进行鉴别。第13页/共41页 4.4.酶法酶法：例：尿激酶的鉴别例：尿激酶的鉴别-气泡上升法气泡上升法 原理：原理：第14页/共41页 方法方法：取取小小试试管管，
7、加加入入尿尿激激酶酶巴巴比比妥妥溶溶液液、牛牛纤纤维维蛋蛋白白原原溶溶液液，再再依依次次加加入入牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原溶溶液液、牛牛凝凝血血酶酶溶溶液液，迅迅速速摇摇匀匀，立立即即置置370.5370.5恒恒温温水水浴浴保保温温，记记时时。反反应应系系统统在在30304040秒秒内内凝凝结结，凝凝结结块块内内有有气气泡泡生生成成，1515分分钟钟内内凝凝结结块块溶溶解解，当当凝凝结结块块溶溶解解时时，气气泡泡逐逐渐渐上上升升。以以0.9%0.9%氯氯化化钠钠作作空空白白，同同法法 操操作作，凝结块在凝结块在2 2小时内不溶。小时内不溶。第15页/共41页5.5.电泳法电泳法：以肝素鉴
8、别为例。：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。第16页/共41页 6.6.生物法生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注静注50%GS50%GS，惊厥停止。，惊厥停止。第17页/共41页（二）杂质检查二）杂质检查 一般杂质检查一般杂质检查 特殊杂质检查：原料药纯度分析特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检
9、查 1.1.原料药纯度分析原料药纯度分析：多糖类多糖类-低聚糖、核酸、蛋白质低聚糖、核酸、蛋白质 酶类药物酶类药物-酶催化反应基本产物的分析，酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。具有一定活性的其他有关酶的检查。第18页/共41页例例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查 选用选用N-N-乙酰乙酰-L-L-酪氨酸乙酯作底物进行酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为25002500个胰蛋白酶单位中不得大于个胰蛋白酶单位中不得大于5050单位，按单位，按每每1mg1mg胰蛋白酶为胰蛋白酶为25002500个单位
10、和每个单位和每1mg1mg糜蛋白糜蛋白酶为酶为10001000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为限度为5%5%（g/gg/g）。）。1:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.05（mgmg）L=0.05/1=5%L=0.05/1=5%2.2.生产过程中杂质的检查生产过程中杂质的检查第19页/共41页 （三）安全性试验（三）安全性试验 热源试验热源试验 异常毒性试验异常毒性试验 :急性毒性物质急性毒性物质 过敏试验：异性蛋白过敏试验：异性蛋白 降压物质试验：导致血压降低的杂质、降压物质试验：导致血压降低的杂质、组组 胺、类组胺胺、类组胺第
11、20页/共41页 无菌试验：活菌无菌试验：活菌 基因工程药物中可能杂质与污染物检查基因工程药物中可能杂质与污染物检查 来源于宿主细胞的残留来源于宿主细胞的残留DNADNA，外源性杂质，外源性杂质 致突变试验致突变试验 生殖毒性试验生殖毒性试验第21页/共41页（四）含量测定（四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量百分含量：适用于结构明确的小分子：适用于结构明确的小分子药药 物或经水解后变成小分子物或经水解后变成小分子的的 药物。药物。生物效价或酶活力单位生物效价或酶活力单位：适用于酶类、：适用于酶类、蛋白质类蛋白质类药物。药物。第22页/共41
12、页含量测定方法含量测定方法：理化分析法理化分析法：化学分析法：重量测定法、滴定分析法化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法法 色谱分析法：色谱分析法：HPLCHPLC法：法：RP-HPLCRP-HPLC、HPIEC HPIEC、HPGFCHPGFC、灌注色谱法、灌注色谱法、HPCEHPCE法法 酶法酶法：酶活力测定法、酶分析法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法电泳法 生物检定法生物检定法返 回第23页/共41页 1 1电化学分析法电化学分析法 药物膜电极药物膜电极 生物组织膜生物组织膜电极电
13、极 药物电极药物电极 微生物电极微生物电极 离子选择性电极法离子选择性电极法 免疫电极免疫电极 免疫场效应免疫场效应管管 酶电极酶电极 第三节第三节 常用定量分析方法及其应常用定量分析方法及其应用用 第24页/共41页 2.HPLC2.HPLC法法 1 1）RP-HPLCRP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸：柱前衍生化自动测定氨基酸 柱：柱：RPRP1818，柱温：柱温：48 48 流动相：流动相：A-0.05%TFAA-0.05%TFA；B-B-乙腈乙腈-异丙醇（异丙醇（4 4：1 1）梯度洗脱梯度洗脱 荧光检测器：荧光检测器：exex=280nm=280nm340nm,340nm,em
14、em=430nm=430nm第25页/共41页 测定测定：样品样品-肽肽 样品水解：样品水解：5.7mol/L5.7mol/L盐酸，盐酸，0.1%0.1%苯酚、苯酚、通通N N2 2，110110，20h 20h 24h24h。样品干燥：真空样品干燥：真空 样品的衍生化：丹酰氯样品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化试剂：水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L 0.4mol/L NaOHNaOH 进样测定进样测定第26页/共41页第27页/共41页第28页/共41页 2 2）HPIECHPIEC 测定对象：蛋白质，多肽测定对象：蛋白质，多肽 柱：离子交换键合相柱：离子交换键合相 流动相：流动相：
15、0.3mol/L0.3mol/L1.0mol/L1.0mol/L的盐的缓冲液。的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤 素类盐素类盐 特点：特点：可回收活性蛋白可回收活性蛋白。第29页/共41页 3 3）HPGFCHPGFC 应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量量 的测定的测定 柱：柱：Beckman Ultraspherogel SEC Beckman Ultraspherogel SEC 30003000 流动相：流动相：0.1
16、mmol/LKH0.1mmol/LKH2 2POPO4 4:0.1mmol/LNa:0.1mmol/LNa2 2SOSO4 4 （1:11:1）0.05%0.05%叠氮化钠叠氮化钠第30页/共41页标准蛋白分子量曲线的制备标准蛋白分子量曲线的制备：醛缩酶醛缩酶血清白蛋白血清白蛋白右旋糖苷蓝右旋糖苷蓝 碳酸酐酶碳酸酐酶抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽 酪氨酸酪氨酸T T0 0 完全排阻完全排阻完全进入填料空隙完全进入填料空隙 T Tt t标准蛋白分子量曲线：标准蛋白分子量曲线：K Kd d-lg M.W.-lg M.W.第31页/共41页 样品测定：样品测定：第32页/共41页应用示例应用示例：ChPChP
17、（20002000）重组人胰岛素的质量控制）重组人胰岛素的质量控制 1 1）鉴别：）鉴别：法法1 1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间 应与对照品的一致。应与对照品的一致。法法2 2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别 进行梯进行梯 度洗脱，供试品的肽图谱与对照品度洗脱，供试品的肽图谱与对照品 的肽图谱一致。的肽图谱一致。第33页/共41页 2 2）检查：）检查：检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌、细菌内毒素。干燥失重、无菌、细菌内毒素。有关物质：供试液
18、经梯度洗脱，按峰面积归一有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化化 法计算有关物质的量不得超过法计算有关物质的量不得超过3.0%3.0%。高分子蛋白质：高分子蛋白质：第34页/共41页 固定相固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量量 为为5000500060006000的球状蛋白。的球状蛋白。流动相流动相：0.4mol/L 0.4mol/L 碳酸氢铵碳酸氢铵-乙腈（乙腈（69:69:3131）测定测定：分别测定供试液（：分别测定供试液（1mg/ml1mg/ml）和对照液）和对照液（将供试液稀释成（将供试液稀释成0.01mg/ml0.01mg/ml），供试液显
19、示），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量1.0%)1.0%)。第35页/共41页 3）效价测定：）效价测定：固定相：固定相：ODS CODS C1818 流动相：硫酸盐缓冲液流动相：硫酸盐缓冲液-乙腈（乙腈（74742626）系统适用性试验系统适用性试验：测定胰岛素主峰和：测定胰岛素主峰和A A2121脱氨脱氨胰胰 岛素峰之间的分离度与拖尾因岛素峰之间的分离度与拖尾因子。子。含量测定含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面：分别进样供试液和对照液，按峰面积积 外标法计
20、算含量。外标法计算含量。第36页/共41页3.3.灌注色谱法灌注色谱法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构 成贯穿孔成贯穿孔 颗粒分离介质颗粒分离介质-POROS-POROSR R。双模式孔结构：双模式孔结构：8080150nm150nm大扩散孔大扩散孔 600600800nm800nm贯穿孔贯穿孔第37页/共41页 允允许许液液体体传传送送流流经经过过分分离离介介质质内内表表面面，使使样样品品由由流流动动相相直直接接灌灌注注入入介介质质颗颗粒粒中中，扩扩散作用不再是主要的。散作用不再是主要的。介介质质颗颗粒粒内内部部可可利利用用反反应应的的表表面面积积增增加加，容容量量和和分分辨辨率率也也随随之之增增加加，可可使使生生物物活活性大分子快速分离纯化。性大分子快速分离纯化。第38页/共41页第39页/共41页第40页/共41页感谢您的观看！第41页/共41页