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1、 食品微生物学检验食品微生物学检验 菌落菌落(jnlu)(jnlu)总数的测定总数的测定 第一页，共五十一页。一一、目的目的1、学习并掌握食品中菌落总数学习并掌握食品中菌落总数(zngsh)(zngsh)测测定方法和原理。定方法和原理。2 2、了解菌落总数测定在对被样品进行、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义卫生学评价中的意义 。第二页，共五十一页。二、原理二、原理(yunl)(yunl)细菌数量的表示方法由于所采用的细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同计数方法不同(b tn)(b tn)而有两种：而有两种：菌落总数菌落总数和和细菌总数细菌总数。第三页，共五十一页。1、菌落
2、总数菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得件下培养后，所得1g或或1mL检样中形成检样中形成的细菌菌落总数。以的细菌菌落总数。以CFU/g（mL）来）来表示。表示。一定条件包括培养基成分、培养温度一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、和时间、pH、是否、是否(shfu)需要氧气需要氧气等。等。第四页，共五十一页。按国家标准方法规定，即在按国家标准方法规定，即在需氧需氧情况情况下，下，36 136 1培养培养482482h，能在，能在平板平板计数琼脂计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求所以厌氧
3、或微需氧菌、有特殊营养要求的以及的以及(yj)(yj)非嗜中温的细菌，由于现有条非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。长。第五页，共五十一页。菌落总数菌落总数并不表示实际并不表示实际(shj)中的所有细中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为所以有时被称为杂菌数杂菌数，需氧菌数需氧菌数等。等。第六页，共五十一页。菌落总数主要作为判别菌落总
4、数主要作为判别食品被污染食品被污染程度程度的标志，也可以应用这一方法观察的标志，也可以应用这一方法观察(gunch)细菌在食品中繁殖的动态，以便对细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。被检样品进行卫生学评价时提供依据。第七页，共五十一页。食品中细菌食品中细菌菌落菌落(jnlu)总数越多总数越多，则食，则食品品含有致病菌含有致病菌的可能性越大，食品的可能性越大，食品质量质量越差越差；菌落总数越小，则食品含有致病；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致大肠菌群和致病菌病菌的检验，才能对食品做出较全面的的检验，才能对食品做出较全
5、面的评价。评价。第八页，共五十一页。2 2、细菌、细菌(xjn)(xjn)总数总数指一定数量或面积的食品样品经过指一定数量或面积的食品样品经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种直接计数。其中包括各种活菌数活菌数和尚未和尚未消失的消失的死菌数死菌数。细菌总数也称细菌直接。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以显微镜数。通常以1g或或1mL样品中的细样品中的细菌总数来表示。菌总数来表示。第九页，共五十一页。三三、材料材料(cilio)(cilio)1、食品检样食品检样2、培养基培养基平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸平板计数培养基，无菌生理盐水
6、或磷酸盐缓冲液盐缓冲液3、其它其它(qt)无菌培养皿，无菌吸管，电炉、无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培恒温培养箱养箱等。等。第十页，共五十一页。四、四、流程流程(lichng)(lichng)1 1、检样检样 2 2、做几个适当倍数的稀释液做几个适当倍数的稀释液3、选择选择23个适宜个适宜稀释度各稀释度各1 1 m mL,L,分别分别(fnbi)(fnbi)加入加入灭菌平皿内灭菌平皿内 4 4、平皿内倾注平皿内倾注15152020 m mL L琼脂培养基，混匀琼脂培养基，混匀5 5、36 136 1培养培养482482小时或（小时或（242242）小时）小时6、记录稀释倍数和相应的记录稀释倍
7、数和相应的各平板各平板菌落菌落数量数量7 7、计算菌落总数计算菌落总数 报告报告 第十一页，共五十一页。五、五、步骤步骤(bzhu)(bzhu)(一一)取样、稀释和培养取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样以无菌操作取检样25g（mL），），放于放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入固体和半固体检样在加入(jir)稀释液后，最好置灭稀释液后，最好置灭菌均质器中以菌均质器
8、中以800010000r/min的速度处理的速度处理12min，制成，制成1:10的均匀稀释液。的均匀稀释液。第十二页，共五十一页。2、用、用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1:10稀释稀释液液1mL，沿管壁徐徐，沿管壁徐徐(xx)注入含有注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管振摇试管或反复吹打混合均匀，制成或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。的稀释液。第十三页，共五十一页。3、另取、另取1mL灭菌吸管，按上项操灭菌吸管，按上项操作顺序作顺序(shnx)，制，制10倍递增稀释液，如倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即此每递增稀释一次即
9、换用换用1支支1mL吸吸管。管。第十四页，共五十一页。4、根据标准要求或对污染情况的估根据标准要求或对污染情况的估计，选择计，选择23个个适宜稀释度，分别在制适宜稀释度，分别在制作作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取度的吸管移取1ml稀释液于灭菌稀释液于灭菌(mijn)平皿平皿中，每个稀释度做中，每个稀释度做两个平皿两个平皿。同时分别取同时分别取1ml稀释液（不含样品）稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作加入两个灭菌平皿内作空白对照空白对照。第十五页，共五十一页。5、稀释液移入平皿后，将稀释液移入平皿后，将冷却冷却至至46琼脂培养基注入平皿约琼脂培养
10、基注入平皿约1520ml，并转动并转动(zhundng)平皿，平皿，混合均匀混合均匀。第十六页，共五十一页。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养温箱内培养482h，水产品，水产品301温箱内培养温箱内培养723h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长漫生长(shngzhng)的菌落时，可在凝固后的琼的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），毫升），凝固后培养。凝固后培养。第十七页，共五十一页。第十八页，共五十一页。（二）（二）菌落菌落记录记录方法方法做做平平板板菌落数菌
11、落数记录记录时，可用肉眼观察，时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度同稀释度的各的各平平板板平均菌落数平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数到达规定培养时间，应立即计数(j sh)(j sh)。如果不能立即计数如果不能立即计数(j sh)(j sh)，应将平板放置于，应将平板放置于0 044，但，但不要超过不要超过24h24h。第十九页，共五十一页。1 1、平皿菌落数的选择平皿菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀
12、释度应为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用采用两个两个(lin)(lin)平皿平皿，大于大于300300的可记为的可记为多不可计。多不可计。第二十页，共五十一页。2、其中一个平板有较大、其中一个平板有较大片状菌落片状菌落(jnlu)生长时，则不宜采用，而应以无片生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落数；若片状菌落不到平板的一半不到平板的一半，而，而其其余一半余一半中菌落分布又很中菌落分布又很均匀均匀，则可以计，则可以计算算半个平板后乘以半个平板后乘以2，以代表一个平板的，以代表一个平板的菌落数。菌落数。第二十一页，共五
13、十一页。3、当平板、当平板(pngbn)上有链状菌落生上有链状菌落生长时，如呈长时，如呈链状生长链状生长的菌落之间无任的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。生长的每一个菌落分开计数。第二十二页，共五十一页。（三）菌落（三）菌落总总数的数的计计算算 1 1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平平均值均值
14、，再将平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数乘以相应稀释倍数(bish)(bish)，作为每，作为每g g（mLmL）中菌落总数结果。）中菌落总数结果。第二十三页，共五十一页。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0 x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x106第二十四页，共五十一页。2 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围
15、内、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下时，按如下(rxi)(rxi)公式计算：公式计算：N=C/N=C/（n n1 1+0.1n+0.1n2 2）d d（1)1)式中：式中：N N 样品中菌落数；样品中菌落数；C C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n nl l 第一个适宜稀释度平板数；第一个适宜稀释度平板数；n n2 2 第二个适宜稀释度平板数；第二个适宜稀释度平板数；d d 稀释因子（第一稀释度）。稀释因子（第一稀释度）。第二十五页，共五十一页。例如：例如：稀释度稀释度1:100（第一（第一(dy)稀释度）稀释度）1
16、:1000（第二稀释度）（第二稀释度）菌落数菌落数232，24433，35232+244+33+35(2+0.12)10-2=544/0.022=24727四舍五入表示为四舍五入表示为:2.5104第二十六页，共五十一页。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0 x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x106第二十七页，共五十一页。3
17、、若所有稀释度的平板菌落若所有稀释度的平板菌落(jnlu)数数均均300，则取，则取最高稀释度最高稀释度的平均菌落数的平均菌落数乘以稀释倍数计算。乘以稀释倍数计算。第二十八页，共五十一页。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0 x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x106第二十九页，共五十一页。4、若所有稀释度平板、若所有稀释度平
18、板(pngbn)菌落数菌落数均均30，则以，则以最低稀释度最低稀释度的平均菌落数乘稀的平均菌落数乘稀释倍数计算。释倍数计算。5、若所有稀释度平板均、若所有稀释度平板均无菌落生长无菌落生长，则应按则应按300，有的又，有的又30，则应以，则应以最接近最接近300或或30的平均菌落数乘以稀释倍数的平均菌落数乘以稀释倍数(bish)计算。计算。第三十二页，共五十一页。（四）（四）菌落菌落(jnlu)计数报告方法计数报告方法1、菌落数在、菌落数在1100时，按四舍五入报时，按四舍五入报告告两位有效数字。两位有效数字。2、菌落数菌落数100时，第三位数字按四舍时，第三位数字按四舍五入计算五入计算(jsu
19、n)，取，取前面两位有效数字前面两位有效数字，为，为了缩短数字后面的零数，也可以了缩短数字后面的零数，也可以10的指数的指数表示。表示。第三十三页，共五十一页。3 3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计若所有平板上为蔓延菌落而无法计数数(j sh)(j sh)，则报告，则报告菌落蔓延菌落蔓延。4 4、若空白对照上有菌落生长，则此次检若空白对照上有菌落生长，则此次检测测结果无效结果无效。5 5、称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，体积为单位报告，体积取样以取样以CFU/mL为单位报告。为单位报告。第三十四页，共五十一页。注意事项注意事项1、无菌操作、无菌操作操作中必须有操作中必须有“无菌操作无
20、菌操作”的概念，所用玻的概念，所用玻璃器皿必须是完全璃器皿必须是完全(wnqun)(wnqun)灭菌的。所用剪刀、灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用包装，应用75%75%乙醇乙醇在包装开口处擦拭后取样。在包装开口处擦拭后取样。操作应当在操作应当在超净工作台超净工作台或经过消毒处理的或经过消毒处理的无菌室无菌室进行。进行。第三十五页，共五十一页。2 2、采样的代表性、采样的代表性 如系固体样品，取样时不应集中如系固体样品，取样时不应集中(jzhng)(jzhng)一点，宜多采几个部位。一点，宜多采几个部位。固体样品固体样品
21、必须经过均质或研磨，必须经过均质或研磨，液体样品液体样品须经过须经过振摇，以获得均匀稀释液。振摇，以获得均匀稀释液。第三十六页，共五十一页。3 3、稀释液、稀释液 样品稀释液主要是样品稀释液主要是灭菌生理盐水灭菌生理盐水，或，或磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（或（或0.1蛋白胨水蛋白胨水），后），后者对食品已受损伤者对食品已受损伤(snshng)(snshng)的细菌细胞有一的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏灭菌蒸馏水水。第三十七页，共五十一页。4 4、每递增稀释一次即换用、每递增稀释一次
22、即换用1 1支支1ml1ml灭菌灭菌吸管。吸管。5 5、倾注用培养基应在、倾注用培养基应在4646水浴内保温，水浴内保温，温度过高会影响温度过高会影响(yngxing)(yngxing)细菌生长，过低细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。宜。第三十八页，共五十一页。6 6、倾注培养基的量规定不一，从、倾注培养基的量规定不一，从121220ml20ml不等，一般以不等，一般以15ml15ml较为适宜，平板较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾过厚可影响观察，太薄又易于干裂
23、。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落弃去，以免与菌落(jnlu)(jnlu)混淆而影响计数混淆而影响计数观察。观察。第三十九页，共五十一页。7、为使菌落能在平板上均匀分布，、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样，可正反两个方向旋转，检样从开始从开始(kish)稀释到倾注最后一个平皿所稀释到倾注最后一个平皿所用时间用时间不宜超过不宜超过20min，以防止细菌有，以防止细菌有所死亡或繁殖。所死亡或繁殖。第四十页，共五十一页。8、培养温度一般为、培
24、养温度一般为37（水产品的（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用故多采用30）。培养时间一般为）。培养时间一般为48h，有些方法只要求，有些方法只要求24h的培养即可计数。的培养即可计数。培养箱应保持一定培养箱应保持一定(ydng)的湿度，琼脂平的湿度，琼脂平板培养板培养48h后，培养基失重不应超过后，培养基失重不应超过15。第四十一页，共五十一页。9 9、为了避免食品中的微小颗粒或培、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨分辨(fnbin)(fnbin)，可同时作一稀释液与琼脂培，可
25、同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于基混合的平板，不经培养，而于4 4环境环境中放置，以便计数时作对照观察。中放置，以便计数时作对照观察。第四十二页，共五十一页。六、六、结果结果(jigu)1、将实验测出的样品数据以表格的将实验测出的样品数据以表格的方式方式(fngsh)报告。报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。生要求的结论。第四十三页，共五十一页。报告报告(bogo)方式方式样品稀释液及菌落数选择稀释度报告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品名称原始数据计算公式报告平均第四十四页，共五十一页。七、思考七、思考(sko)1、
26、什么是细菌菌落总数（什么是细菌菌落总数（cfu）？）？2、影响杂菌总数准确性的因素影响杂菌总数准确性的因素(yns)有哪有哪些？些？3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌、在食品卫生检验中，为什么要以细菌菌落总数为指标？菌落总数为指标？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在持在461的温度？的温度？第四十五页，共五十一页。酱油酱油(jingyu)（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：30MPN/100mL肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出第四十六页，共五十一页。全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、
27、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级特级一级一级二级二级细菌菌落总数细菌菌落总数(zngsh)：200003000050000（CFU/ml）大肠菌群大肠菌群409090（MPN/100g）肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出不得检出第四十七页，共五十一页。巴氏杀菌巴氏杀菌(shjn)乳（乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：细菌菌落总数：30000CFU/mL大肠菌群：大肠菌群：90MPN/100mL肠道致病菌：肠道致病菌：不得检出不得检出第四十八页，共五十一页。生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数菌落总数cfu/m
28、l：100总大肠菌群总大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出耐热耐热(nair)大肠菌群大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml：不得检出：不得检出第四十九页，共五十一页。瓶瓶(桶桶)装饮用纯净水卫生标准装饮用纯净水卫生标准(GB17324-2003)细菌菌落细菌菌落(jnlu)总数总数cfu/ml：20大肠菌群大肠菌群MPN/100ml：3致病菌致病菌(肠道致病菌和致病性球菌肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出：不得检出霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出不得检出第五十页，共五十一页。内容(nirng)总结食品微生物学检验 菌落总数的测定。细菌总数也称细菌直接(zhji)显微镜数。菌量/(个/g或mL)。=544/0.022=24727。5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。1、菌落数在1100时，按四舍五入报告两位有效数字。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在461的温度。致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出第五十一页，共五十一页。