第四章(分子发光分析.ppt

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1、第四章(分子发光分析 分子发光分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光。室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量（光能、化学能、电能或热能）后被激发为激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光发光”。2023/4/19S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫2023/4/19非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。系间窜越

2、系间窜越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子的自旋状态。如S1T1S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2 内转换振动弛豫2023/4/19非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程内转换内转换：相同多重度电子能级间的无辐射跃迁过程。如S2S1，T2T1。在10-1310-11s内完成。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2 内转换

3、振动弛豫2023/4/19辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，荧光的发射波长比吸收波长要长；2 2 1；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2 内转换振动弛豫2023/4/19辐射能量传递过程辐射能量传递过程磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0 激发振动弛豫内转移

4、系间跨越振动弛豫 T1发光速度很慢：10-410 s。光照停止后，可持续一段时间S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2 内转换振动弛豫2023/4/19二、激发光谱与发射光谱二、激发光谱与发射光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，

5、荧光强度最大；2023/4/192.2.荧光发射光谱荧光发射光谱(或磷光发射光谱或磷光发射光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。2023/4/193.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。2023/4/19b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振

6、动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2)。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2 内转换振动弛豫2023/4/19c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2023/4/19三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.1.分子产

7、生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（f）：表示物质发射荧光的能力2023/4/19 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，可可以以用用以以下下数数学学式式表表示示。如如外外转转换换过过程程速速度度快快，不不出出现荧光发射；现荧光发射；Kf 荧光发射过程的速率常数荧光发射过程的速率常数Ki 其他有关过程的速率常数的总和其他有关过程的速率常数的总和 Kf主要决定于物质的化学结构，而Ki 则主要决定于物质所处的化学环境。2

8、023/4/192.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共共轭轭效效应应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 含 *跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强化合物（在环己烷中）f /nm 苯 0.07 283 联苯 0.18 316对-联三苯 0.93 3422023/4/19（3）刚刚性性平平面面结结构构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2023/4/19（4）取代基效应取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基对该化合物的

9、荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可归为下列几种类型：第一，给电子基团常常使荧光增强；第二，吸电子基团会减弱甚至破坏荧光；第三，同电子体系相互作用小的取代基和烷基对发光影响不明显；第四，将一个高原子序数高原子序数的原子引入，常常增强磷增强磷光而减弱荧光；光而减弱荧光；第五，双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。2023/4/192023/4/19四、影响荧光强度的环境因素四、影响荧光强度的环境因素 relation between fluorescence and molecular structure 影响荧光强度的外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响

10、由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同 如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况 溶剂 介电常数 荧光峰/nm 荧光效率四氯化碳 2.24 390 0.002氯仿 5.2 398 0.041丙酮 21.5 405 0.055乙 38.8 410 0.0642023/4/192.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，一般来说，溶液的荧光强度随着温度升高而降低。3.溶液溶液pH 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关，因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值。如苯酚苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但

11、在碱性溶液中，无荧光再如 苯苯胺胺在pH712溶液中有蓝色荧光，而在pH小于2大于13的溶液中都不发荧光。另外金属离子与有机试剂形成的发发光光螯螯合合物物也受到溶液的pH影响2023/4/194.4.内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象 自自吸吸收收现现象象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”，如色胺酸中的重铬酸钾；2023/4/195.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度

12、降低的现象称为荧光猝灭荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。（1）碰撞猝灭 M+hM*,M*+QM+热（2）静态猝灭 M+QMQ 非荧光（3）转入三重态的猝灭 三重态O2（4）发生电子转移反应的猝灭 M+Q发生电子转移（5）荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高2023/4/19第四章第四章 分子发光分析法分子发光分析法一、一、仪器与结构流程仪器与结构流程instrument and general process 二、二、荧光分析法和应用荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、三、磷光分析法及应用磷光分析法及应用phosphoresc

13、ence analysis and application第二节 分子荧光与磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis 2023/4/19一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第

14、二单色器；光源光源：氙灯和高压汞灯样品池：样品池：石英石英检测器检测器：光电倍增管。2023/4/19二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级；检测下限：0.10.001g/cm-3（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。2023/4/192.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的关系式为 I If f=2.3=2.3f fI I0 0bcbc式中：f为

15、荧光效率，I0为激发光的强度，荧光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。在一定条件下，f、I0、b均为常数，所以上式可写成 I If f=K=Kc c即荧光强度与荧光物质的浓度荧光强度与荧光物质的浓度c c成正比成正比。荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。2023/4/19（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；2023/4/193.3.

16、荧光分析法的应用荧光分析法的应用 目目前前荧荧光光分分析析大大多多用用于于定定量量分分析析，由由于于自自身身发发射射荧荧光光的的化化合合物物不不多多，因因此此往往往往利利用用有有机机试试剂剂与与荧荧光光较较弱弱或或不不显显荧荧光光的物质的物质结合结合形成发形成发荧光荧光的的配合物配合物来进行测定。来进行测定。(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。（2 2）有机化合物的分析）有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂脂肪肪族族化化合合物物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反

17、应后反应后才能进行分析。2023/4/192023/4/192023/4/19三、磷光分析法及应用三、磷光分析法及应用 与荧光相比，磷光具有两个特点与荧光相比，磷光具有两个特点（1 1）磷光辐射的波长比荧光长）磷光辐射的波长比荧光长（2 2）磷光的寿命比荧光长）磷光的寿命比荧光长1.1.磷光强度与磷光物质浓度的关系磷光强度与磷光物质浓度的关系 当当磷磷光光物物质质浓浓度度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系式为 Ip=2.3pI0bc式中：p为磷光效率，I0为激发光的强度，磷光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。在一定条件下，p、I0、b均为常数，所以上式可写成：I Ip p=K=

18、Kc c 即磷光强度与磷光物质的浓度磷光强度与磷光物质的浓度c成正比成正比。2023/4/192.温度对磷光强度的影响温度对磷光强度的影响随着温度的降低，磷光逐渐增强3.重原子效应重原子效应使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称作重原子效应。4.低温磷光低温磷光用液氮作冷却剂（77K）2023/4/195.室温磷光室温磷光由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择的限制，发展了以下几种室温磷光法：的限制，发展了以下几种室温磷光法：（1）固体表面室温磷光法）固体表面室温磷光法 此法基于测量室温下此法基于测量室

19、温下吸附吸附于固体基质（于固体基质（载载体体）上的有机化合物所发射的磷光。理想的）上的有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。光背景。2023/4/19（2）胶束增稳的溶液室温磷光法）胶束增稳的溶液室温磷光法 当向溶液中加入适量的当向溶液中加入适量的表面活性剂表面活性剂，形成，形成胶胶束束，由于胶束的多相性，改变了，由于胶束的多相性，改变了磷光团磷光团的微的微环境和定向的

20、约束力，从而强烈影响了磷光环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，团的物理性质，减小减小了内转化和碰撞了内转化和碰撞能量损能量损失失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。量室温磷光。2023/4/196.磷光分析仪磷光分析仪 和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计上配上磷光附件后，即可用于磷光测定。上配上磷光附件后，即可用于磷光测定。（1）试样室）试样室 将试样放在盛将试样放在盛液氮液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于的石英杜瓦

21、瓶内，即可用于低温低温磷光测定。磷光测定。（2）磷光镜）磷光镜 有些物质有些物质同时同时会发生会发生荧光和磷光荧光和磷光，为了能在同，为了能在同时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个间各装一个斩波片斩波片，并由一个同步马达带动，这种，并由一个同步马达带动，这种装置称作装置称作磷光镜磷光镜。2023/4/192023/4/197 7、磷光分析法的应用、磷光分析法的应用 磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少，它主要用于测定有机化合物。(1).稠环芳烃

22、分析 采采取取固固体体表表面面室室温温磷磷光光分分析析法法快快速速灵灵敏敏测测定定稠稠环环芳芳烃烃和和杂环化合物（致癌物质）；见表杂环化合物（致癌物质）；见表(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析(3).药物分析 见表2023/4/192023/4/19第四章 分子发光分析法一、一、基本原理基本原理principle 二二 装置与技术装置与技术instrument and technology三三、化学发光分析的特点、化学发光分析的特点characteristics第三节 化学发光分析法molecular luminescenceanalysischemiluminescenceanalys

23、is2023/4/19化学发光化学发光 某某些些物物质质在在进进行行化化学学反反应应过过程程中中，由由于于吸吸收收了了反反应应产产生生的的化化学学能能而而被被激激发发，从从激激发发态态返返回回基基态态时时，发发射射出出一一定定波波长长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光化学发光。化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光生物发光(bioluminescence)。化学发光分析化学发光分析 利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。2023/4/19一、基本原理 principle1.1.化学发光反应化学发光反

24、应 在化学反应过程中，某某些些反反应应产产物物接受化学能而被激激发发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h（1）能能快快速速地地释释放放出出足足够够的的能能量量。能能产产生生化化学学发发光光的的物物质质大大多多为为有有机机化化合合物物，芳芳香香族族化化合合物物；化化学学发发光光反反应应多多为为氧氧化化还还原原反反应应，激激发发能能与与反反应应能能相相当当，E=170300 kJ/mol；发发光光位于可见光区；位于可见光区；（2）反应历程有利于激发态产物的形成；）反应历程有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以激发态分子能够以辐射跃迁辐射跃迁的方式返回基

25、态；的方式返回基态；2023/4/192.2.化学发光效率和发光强度化学发光效率和发光强度化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：化学效率化学效率主要取决于发光所依赖的主要取决于发光所依赖的化学反应本化学反应本身身；而；而发光效率发光效率则取决于则取决于发光体本身发光体本身的结构和性质，的结构和性质，也受也受环境环境的影响。的影响。2023/4/19发光强度发光强度 化学发光反应的发光强度化学发光反应的发光强度I Iclcl是以单位时间内发射的光子是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度(单位时

26、间发射的光量子数单位时间发射的光量子数)：如果反应是一级动力学反应，t t时刻的化学发光强度时刻的化学发光强度I Iclcl与该时刻的分析物浓度与该时刻的分析物浓度c c成正比成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。2023/4/193.3.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应 主要有主要有O O3 3，NO,SNO,S的化学发光反应，可用于监测空的化学发光反应，可用于监测空气中的气中的O O3 3，NO,NONO,NO2 2，H H2 2S,SOS,SO2 2和和COCO等等.

27、a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*+O2 NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；2023/4/19b.乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：反应，生成激发态甲醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；2023/4/19（2 2）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、

28、Hg、Au、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：2023/4/19（1）该发光反应速度慢，某些该发光反应速度慢，某些金属离子金属离子可可催化催化反应；利用反应；利用这一现象可这一现象可间接测定间接测定这些金属离子。可测痕量的这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸

29、 +O2 酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶2023/4/192023/4/19二、装置与技术 instrument and technology 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静静态态方方式式：用用注注射射器器分分别别将将试试剂剂加加入入到到反反应应器器中中混混合合，测最大光强

30、度或测最大光强度或总发光强度总发光强度；试样量小，重复性差；试样量小，重复性差；流流动动注注射射方方式式：用用蠕蠕动动泵泵分分别别将将试试剂剂连连续续送送入入混混合合器器，定时定时通过测量室，连续发光，测定通过测量室，连续发光，测定最大光强度最大光强度；试样量大；试样量大；2023/4/19三、特点 characteristics1.1.灵敏度极高灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2 2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背

31、景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。2023/4/19本章小结本章小结一一.荧光与磷光的产生荧光与磷光的产生辐射跃迁辐射跃迁：荧光及磷光：荧光及磷光;非辐射跃迁非辐射跃迁：振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；：振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱;荧光量子产率荧光量子产率荧光效率与物质分子结构的关系荧光效率与物质分子结构的关系：跃迁类型，共轭：跃迁类型，共轭效应，刚性平面结构，取代基效应效应，刚性平面结构，取代基效应;荧光效率与环境因素的关

32、系荧光效率与环境因素的关系：溶剂，温度，：溶剂，温度，pH。2023/4/19二二.荧光与磷光分析法荧光与磷光分析法仪器结构仪器结构：两个单色器，光源与检测器成直角两个单色器，光源与检测器成直角定量依据与方法定量依据与方法：If=Kc,Ip=Kc应用应用：定量，有机，无机：定量，有机，无机三三.化学发光分析化学发光分析化学发光的产生化学发光的产生化学发光效率化学发光效率cl=rf总发光强度与浓度的关系：总发光强度与浓度的关系：A=clc=Kc化学发光装置化学发光装置发光反应室光检测器信号放大显示发光反应室光检测器信号放大显示本章作业：本章作业：p65：1，2，4三大题。三大题。2023/4/19此此课件下件下载可自行可自行编辑修改，修改，仅供参考！供参考！感感谢您的支持，我您的支持，我们努力做得更好！努力做得更好！谢谢!