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1、蛋白组学在肾脏病研究中的应用蛋白组学在肾脏病研究中的应用上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科王伟铭王伟铭前言p肾脏病的治疗进展缓慢p细微的组织病理学：早期诊断、预后追踪以及疗效观察p尿液：与泌尿系统之间存在着天然的联系，使得尿液在反映泌尿系统功能方面具有“地理”优势n体外的肾活检蛋白组学与肾脏pPubMed：n关键词：proteomics or proteome or proteomic together with kidney or renal or urine or urinaryn：过去5年 1156 篇p解决临床及基础问题的途径内 容p蛋白组学技术蛋
2、白组学技术p蛋白组学与肾脏病研究蛋白质组和蛋白质组学p蛋白质组（proteome）：细胞、组织或机体在特定的时间和环境中基因组所动态表达的蛋白质。p蛋白质组学（Proteomics）：以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体，并在此基础上对疾病发病机理、预后判断等方面进行探索 n从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域 Proteomics includes not only the identification and quantification of p
3、roteins,but also the determination of their localization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,their function.Nephrol Dial Transplant(2010)25:1116研究过程：蛋白质分离、鉴定以及信息资料分析处理三部分蛋白质组学重要工具1.蛋白质的分析分离技术。n2D-SDS-PAGE：应用最为广泛n1D-SDS-PAGEn高效液相层析（HPLC）n等电聚焦（IEF）n毛细管电泳（CE）n离子交换液相层析（LC）n反向（RP）-HPLC串联
4、。Two-dimensional Gel ElectrophoresisCut out Spots and Identify Proteins by Tandom Mass Spectroscopy2.质谱（MS）技术：蛋白质肽的精确质量测定对肽序列进行分析质谱技术pMass spectrometry-based proteomic technologiesn基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS):利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化n电喷雾电离质谱(ESI-MS):在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化p表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced l
5、aser desorption ionization time-of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）p通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间(TOF),即可计算得到准确的肽段质量 质谱技术Four different types of MS-based proteomic technologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MSFour different types of MS-based proteomic technologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)C
6、E-MS 不同蛋白质组学技术的比较技术技术 优势优势局限性局限性2DE-MS适合大分子，通过二维适合大分子，通过二维斑点可估计实际分子量斑点可估计实际分子量并进行排序并进行排序 无法检测分子量无法检测分子量20kD）耗时，敏感度与成分有关，耗时，敏感度与成分有关，检测物分子量范围有限检测物分子量范围有限CE-MS自动化，敏感度高，省自动化，敏感度高，省时，样本量小，多维度时，样本量小，多维度不适合于大分子不适合于大分子（20kD）多维液相色谱多维液相色谱-质谱技术质谱技术 p通过相对和绝对定量的同位素标签试剂（iTRAQ）,还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。pICAT技术是指采用同位素标记多肽
7、或蛋白质的亲和标签技术(isotope coded affinity tags,ICAT)p可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质 p质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等 新技术Agilent HPLC-Chip II，是高通量、微型化和自动化为特点的蛋白组学检测技术。能同时从微量的样品中检测多种蛋白质或多肽，用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定。数据分析data miningp蛋白质组研究中的生物信息学蛋白质组研究中的生物信息学n蛋白质氨基酸序列蛋白质氨基酸序列(sequence)数据库数据库n蛋白质结构域与家族数据库蛋白质结构域
8、与家族数据库n蛋白质高级结构及分类数据库蛋白质高级结构及分类数据库n蛋白质蛋白质2DE图谱数据库图谱数据库n蛋白质相互作用数据库蛋白质相互作用数据库内 容p蛋白组学技术p蛋白组学与肾脏病研究蛋白组学与肾脏病研究尿蛋白质组pDavis 和Spahr（2001）：尿蛋白质组研究的早期开拓者n用LC-MS/MS 方法分析了酶切后的混合尿样，共鉴定出124 个蛋白。pThongboonkerd（2002）：第一张人尿蛋白质组2D 图n67 种蛋白及它们的异型体p蛋白大部分是尿液中的高丰度蛋白p由病变组织漏出、分泌、裂解而释放出的生物标志物很多都是低丰度蛋白尿液标本的准备标本收集:空腹晨尿或中段尿标本处
9、理：蛋白测定 乙醇沉淀ethanol precipitation 真空浓缩vacuum centrifugation 微浓缩microconcentration 反相捕获柱reverse phase trapping column标本储存：70或 20稳定性/差异性p尿蛋白质组在个体间存在着明显的差异p由于锻炼、饮食、生理节奏等因素的影响，同一个体不同时间段的尿蛋白质组也会发生改变n尿蛋白组随时间发生变化，晨尿较其他时间点包含更多蛋白点n不同天内所得尿蛋白组间较同一天内不同时间点间差异更大稳定性/差异性p个体间较个体内存在更明显的差异p早期小样本试验得到的候选标志物必须经过大样本的验证，才能确
10、定哪些蛋白的变化真正是由疾病导致的，而并非生物学上的变异造成的糖尿病肾病糖尿病肾病pBellei et al.(2008)p方法：2DE 和ESI-Q-TOF MS/MS p2型糖尿病早期肾脏改变：尿液生物标记物n正常白蛋白尿(n=10)、2型糖尿病肾病(n=12)、健康对照(n=12).p11 种差异表达蛋白n3 种蛋白减少：前列腺酸性磷酸酶前体（prostatic acid phosphatase precursor）,核酸核酶,激肽释放酶-3n 8种蛋白进行性增加：transthyretin precursor,免疫球蛋白(Ig)C链 region,Ig V链-II region Cum
11、,Ig-V链-III region SIE,碳酸酐酶 1,血浆视黄醇结合蛋白,2-微球蛋白前体,2-糖蛋白 1.Proteomics Clin.Appl.,2(4):478-491.糖尿病肾病糖尿病肾病pLapolla et al.(2009)p方法：MALDI-MSp病例：糖尿病、肾病、糖尿病肾病、健康对照 p差异蛋白：1219,1912,和2049 Da pMALDI-TOF/TOF：uromodulin,I型胶原1 前体,和 IV型胶原-5 链前体J.Mass Spectrom.,44(3):419-425.糖尿病肾病糖尿病肾病pWu J,Chen YD,Gu W（2008）p方法：SE
12、LDI-TOF-MS p病例：106例正常、微量、大量白蛋白尿DM、50例健康对照p差异蛋白：4239.0,4453.5,5281.1,5898.5 Dap特异性：80%；敏感性：75%.Wu et al./J Zhejiang Univ-Sci B(Biomed&Biotechnol)2010 11(4):227-237糖尿病肾病糖尿病肾病pJiang et al.(2009a)p方法：2DE和MALDI-TOF/MSp病例：2型糖尿病正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和健康对照p差异蛋白：12种蛋白nE-cadherin 增加 1.3-,5.2-,8.5倍 nWestern blot
13、：尿标本中表达增加nELISA：sE-cadherin/肌酐比显著增高(DN)n免疫组化：肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少(DN)pE-cadherin可作为糖尿病肾病相关的新的标志物Diabetes Metab Res Rev 2009;25:232241.糖尿病肾病糖尿病肾病pJiang et al.,2009b p方法：2DE和MALDI-TOF-MSp目的：监测糖尿病肾病的发生发展p病例：12例DN(1型和2型糖尿病)、6 健康对照p差异蛋白：orosomucoidp验证：90例糖尿病患者、30例健康对照n尿orosomucoid排泄率(UOER)随白蛋白尿进行性上升 p尿o
14、rosomucoid可作为DN的生物标志物NEPHROLOGY 2009;14,3323372-D gel electrophoresis(2-DE)images of urine samples from diabetic nephropathy(DN)patients and healthy controls.NEPHROLOGY 2009;14,332337IgA肾病肾病pHaubitz et al.(2005)p方法：CE-MSp差异：正常对照（57例）nIgAN特异性尿多肽谱尿多肽谱pIgAN（45例）：敏感性100%、特异性90%p膜性肾病（13例）：敏感性77%、特异性100%n
15、3种多肽masses：2752.4,2427.1,2057.3 Da p血清白蛋白片段Kidney Int.,67(6):2313-2320.IgA肾病肾病pRocchetti et al.(2008)p方法：2DE和 nano-HPLC-ESI-MS/MSp病例：正常对照20例、IgAN R(ACEI)9例、IgAN NR 9例p差异蛋白:激肽原,inter-trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor(ITIH4),甲状腺素转运蛋白(transthyretin)p验证：IgAN R 和IgAN NR之间尿差异蛋白显著不同p免疫杂交：低水平的尿激肽原提
16、示IgAN对ACEI治疗反应差的预测指标Proteomics,8(1):206-216.肾小球肾炎肾小球肾炎pMischak（2004-2005）p方法：CE-MS-生物信息的方法p构建一个尿液（和其他体液）蛋白质组诊断模型用于各种可以进展为肾衰的小球疾病的诊断和鉴别诊断。pMCD(16)、MN(18)、FSGS(10)与正常尿液(57)Kidney Int,2004,65(6):2426-34 Kidney Int,2005,67(6):2313-20Mass Spectrom Rev.2009;28(5):703724.肾小球肾炎肾小球肾炎p正常组多肽模式：n173 个在90%以上正常人尿
17、液中出现的多肽，n690 个在50%以上正常人尿液中出现的多肽，p疾病分别构建了含500 个以上多肽模式p对疾病分类的准确性：nMCD/FSGS 71.4%，MN 92.9%。Kidney Int,2004,65(6):2426-34 Kidney Int,2005,67(6):2313-20Mass Spectrom Rev.2009;28(5):703724.狼疮性肾炎狼疮性肾炎pMosley et al.(2006)pSELDI-TOF MSp差异蛋白：m/z 3340 和3980 Dap活动和非活动LN：敏感性和特异性均92%p预测LN的复发与缓解p未作进一步鉴定active(n=26
18、)and inactive(n=49)lupus nephritis patients ROC curve for the two biomarkers was generated using logistic regression scores,with an area under the curve of 0.967.狼疮性肾炎狼疮性肾炎pSuzuki et al.(2009)pSLE或青少年特发性关节炎：8种生物标记物 m/z of 2.7,22,23,44,56,79,100,133 kDa（LN）p鉴定：n23-kDa：脂质运载蛋白型 前列腺素-D 合成酶(L-PGDS),n56-k
19、Da：1酸性糖蛋白(AGP)or类粘蛋白(orosomucoid,ORM)n79-kDa：转铁蛋白(Tf),n133-kDa：铜蓝蛋白 (Cp)n其它：白蛋白或白蛋白片段 p这些蛋白可能可作为预测LN病程Pediatr Res.2009 May;65(5):530-6.狼疮性肾炎狼疮性肾炎pZhang et al.(2008)p方法：SELDI-TOF-MSp选择27/176种差异表达蛋白（不同活动期）p 3中低分子生物标记物nHepcidin的20、25氨基酸异构体n1-antitrypsin片段n白蛋白p肝性杀菌肽(hepcidin)：与LN促炎症细胞因子有显著相关意义Kidney Int
20、ernational 74,799807(2008)Urine SELDI spectra of class IV SLE nephritis flarecycles.(a)The spectra of a whole flare cycle are presentedbetween the 2000 and 10,000 Da region.The LMW urineproteome shows an overall increase in peaks between 2000 and4000 Da as flare approaches,which then decrease during
21、 flaretreatment.(b)The spectra from 4 months pre-flare and flare of a class IV GN patient showing that some protein ions decrease at the flare.Intrarenal expression of hepcidin.Immunohistochemical staining for hepcidin is shown for renal biopsy material from a normal kidney(CONT),and three patients
22、with class IV SLE nephritis(SLE).The positive cells are infiltrating interstitial leukocytes.p甘露聚糖结合凝集素甘露聚糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)与造影剂引起的急性肾损伤(CIN)有关p凝集素途径可能参与造影剂致肾损伤凝集素途径可能参与造影剂致肾损伤pMBL:CIN可能的生物标记物可能的生物标记物 造影剂肾损伤造影剂肾损伤ARFpExosomal fetuin-A:biomarker of AKIn大鼠ARF模型-患者Western blots证实pischem
23、ic ARF:n血浆谱:NGAL、cystatin Cn尿谱:NGAL,IL-18,KIM-1,cystatin C,a1-MG,fetuin-A,Gro-alpha,meprin.n评价ARF的持续时间和严重性n预测疾病的进展和不良临床预后n有助于区分ARF的不同病因学Kidney Int.2006;70:18471857.Curr Opin Nephrol Hypertens.2008;17:127132肾脏纤维化机制研究肾脏纤维化机制研究 Phosphoproteomic Study of Human Tubular Epithelial Cell in Response to Tran
24、sforming Growth Factor-1-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition Yong-Xi Chen,Ya Li,Wei-Ming Wang,Wen Zhang,Xiao-Nong Chen,Yin-Yin Xie,Nan Chen Am J Nephrol 2010;31:2435 利用同位素标签技术（利用同位素标签技术（iTRAQ）对对TGF-TGF-诱导人肾小管上诱导人肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白的蛋白质组学研究皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白的蛋白质组学研究结果：结果：TGF-TGF-可致肾小管上皮细胞损伤可致肾小管上皮细
25、胞损伤转分化转分化-形态学形态学改变改变转分化转分化-形态学形态学改变改变促凋促凋亡亡-流流式式促凋亡促凋亡-流式流式T TG GF F-b b1 1致致肾肾小小管管上上皮皮细细胞胞损损伤伤转分化转分化-R Real-time PCR转分化转分化-Western blot结果：磷酸化蛋白富集结果：磷酸化蛋白富集123123123332112结果：iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS 分析p本次质谱鉴定n检测到2493个质谱峰(spectra)n鉴定出1298个质谱峰，所有检测出质谱峰52.1%（1298/2493）n特异性肽段数为818个n通过ProteinPilot软件鉴定出差异
26、蛋白38个p19表达上调p19表达下调结果结果：19个表达下调磷酸化蛋白及磷酸化位点个表达下调磷酸化蛋白及磷酸化位点结果结果：1919个表达上个表达上调调磷酸化蛋白及磷酸化位点磷酸化蛋白及磷酸化位点结果：PANTHER功能分类结果p上调磷酸化蛋白19个，功能分类总共有22个n部分蛋白存在多种功能pDNAH5-Dynein heavy chain 5pERC1-ELKS/RAB6-interacting/CAST family member 1 pGAK-Cyclin G-associated kinasen蛋白分类中占到前三位p细胞骨架蛋白p核酸结合蛋白 p分子伴侣结果结果：Western b
27、lot 验证磷酸化蛋白差异表达验证磷酸化蛋白差异表达p对HK-2予以不同时间TGF-b1刺激后n磷酸化moesin、磷酸化HSP90a表达上调n与iTRAQ结果一致结果：TGF-致肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白调控网络p表达上调磷酸化蛋白中，13 个蛋白存在相互作用n细胞死亡调控n能量代谢n蛋白调控n应激和防御等细胞事件p参与网络调控蛋白涉及nNF-kBnMAPK等信号蛋白结语p尿液蛋白组学n生物学标记-肾脏疾病以及非肾脏疾病（冠心病、前列腺癌、膀胱癌等）n许多生物标志物被发现n更好理解肾脏的病理生理学结语p需要标准化的尿液蛋白组学分析p推荐步骤：1.确定明确的临床问题2.标本收集和准备的方案3.可靠的、高通量、高效的技术分析平台4.适当的统计方法：与专业相结合5.通过大样本对潜在的标记物进行进一步验证6.对潜在的生物标记物分析（包括测序等）结语p不存在“完美的标志物”n明确对应某种疾病的单一分子p一组标志物：更适合疾病的诊断检测和疗效观察谢谢！谢谢！谢谢 谢！谢！