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1、液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。第1页/共74页液相色谱-质谱联用要解决的重要问题液相色谱流动相对质谱工作条件的影响质谱离子源温度对液相色谱分析源的影响 第2页/共74页一、LC-MS联用的接口技术常用于液相色谱质谱联用技术的接口主要有移动带技术（MB）、热喷雾接口、粒子束接口（PB）、快原子轰击（FAB）、电喷雾接口（ESI）等。其中，电喷雾接口的应用极为广泛。1.电喷雾（ESI）1）特点：具有
2、高的离子化效率，对蛋白质而言接近100%；有多种离子化模式可供选择；对蛋白质而言，稳定的多电荷离子的产生，使蛋白质分子量测定范围可高达几十万甚至上百万；“软”离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰。第3页/共74页2）ESI接口的结构ESI 源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统。第4页/共74页第5页/共74页电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm 的金属毛细管。在它上面施加38kV 的电压时。由于毛细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达106 V/m。当流速为0.55Lmi
3、n 的LC 流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。第6页/共74页离子的形成：当表面带有大量电荷的精细液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到Rayleigh 极限时，液珠会分裂成更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩和液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。第7页/共74页离子的输送：大气压条件下
4、形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）,通过取样孔（sampling cone）进入质谱真空区。离子流通过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。第8页/共74页电喷雾电离源电喷雾电离源 ESINeedle喷雾针多层套管构成溶液雾化气（N2/Air）Nebulizing Gas干燥气干燥气Drying Drying GasGas（NN22）加快溶剂挥发第
5、9页/共74页电喷雾电离源电喷雾电离源 ESITaylor锥库 仑 分 裂Rayleigh稳定限形成正/负气相离子被吸入质量分析器第10页/共74页电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（110Lmin1）将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，使得接口可与大流量（约1mLmin1）的HPLC联机使用第11页/共74页2.大气压化学电离源（APCI）大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning 等人于20 世纪70 年代初发明的，20 世纪80 年代末得到突飞猛进的发展，与ESI 源的发展基本上是同步的。但是APCI 技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电
6、启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。第12页/共74页大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从LC流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子M+H+或M-H-，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。APCI是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定。另外，APCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。第13页/共74页优点：形成的是单电
7、荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量级。第14页/共74页大气压化学电离源大气压化学电离源 APCINeedle喷雾针（加热）Corona Needle电晕针reagent gas试剂气离子分子反应第15页/共74页第16页/共74页电喷雾与大气压化学电离的比较电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCIAPCI电离是高压放电发生了质子转移而生成MMHH+或M-HM-H-离子。样品流速
8、样品流速：APCIAPCI源可从0.20.2到2mL2mLminmin；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1mL0.2-1mLmin.min.断裂程度断裂程度；APCIAPCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCIAPCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷多电荷：APCIAPCI源不能生成一系列多电荷离子第17页/共74页二、LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大
9、分子（如蛋白质）。APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。第18页/共74页2.正、负离子模式的选择：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。第19页/共74页3.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液。LC/MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须l mmol/L。第20页/共
10、74页4.流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1-50 m mL/min，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l-2.1 mm内径的微柱，ESI源最高允许l mL/min，建议使用200-400 m mL/min；APCI的最佳流速l mL/min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱第21页/共74页5.辅助气体流量和温度的选择 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的
11、组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。第22页/共74页六大禁止 禁止高浓度待测样品禁止高浓度待测样品 1ppm 禁止用洗涤剂清洗玻璃容器禁止用洗涤剂清洗玻璃容器 禁止用塑料容器装有机溶剂禁止用塑料容器装有机溶剂 禁止用不挥发性缓冲盐禁止用不挥发性缓冲盐 禁止高浓度有机缓冲盐禁止高浓度有机缓冲盐 10mM 禁止无机样品进样禁止无机样品进样第23页/共74页建建议议 采用等度洗脱采用等度洗脱 采用甲醇作为流动相采用甲醇作为流动相 比例偏大比例偏大 采用小内径的色谱柱采用小内径的色谱柱 如如2.1mm2.1mm 除除MRM模式模式 不能超过不能超过4个通道个通道 一个色谱峰的数据
12、点在一个色谱峰的数据点在15-2515-25个个第24页/共74页建建议议 ESI广泛适用广泛适用 APCIAPCI效果更佳效果更佳 正模式广泛适用正模式广泛适用 负模式本底更低，信噪比更高负模式本底更低，信噪比更高第25页/共74页影响分子量测定的因素影响分子量测定的因素1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响，还影响LC的峰形。2）气流和温度：水含量高及流量大时要相应增加。3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些5）选择合适的液相色谱类型：正相、反相、选择合适的色谱柱第26页/共74
13、页6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时会使多电荷离子比例低，多聚体也减少7）样品结构和性质8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好9）样品浓度第27页/共74页分子量测定中的误判分子量测定中的误判溶剂中的杂质来自于塑料添加剂的峰样品容器不干净，常见表面活性剂的峰进样系统污染样品在源内碎裂，形成碎片离子第28页/共74页分子量测定失败的原因分子量测定失败的原因a）流动相不合适b）不挥发性盐的影响c）成分复杂，杂质太多d)样品浓度不够e）pH值不合适f）样品在源内分解或碎裂第29页/共74页目标化合物
14、分析（1）选择离子监测（SIM）SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。第30页/共74页（2 2）母离子扫描母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。第31页/共74页(3)中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18
15、Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。第32页/共74页三、LC-MS的应用医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料第33页/共74页LC-MS应用小分子化合物分析第34页/共74页第35页/共74页Mesoc
16、arb(双苯斯酮胺)第36页/共74页第37页/共74页第38页/共74页槟榔有效成分的分析槟榔含有多种人体所需的营养元素和有益物质，同时也含有多种药理活性成分，主要包括生物碱、酚类化合物、脂肪油以及多种氨基酸和各种各样的矿物质等。槟榔的主要作用是由槟榔碱的功效体现的。槟榔碱(Arecoline)属于生物碱，是一种含氮杂环的有机物，分子式C8H13O2N，沸点209，溶于醇、醚、氯仿和苯等有机溶剂，不溶于水。第39页/共74页第40页/共74页第41页/共74页1根据“氮规律”质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个N原子。2结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比155的分子离子峰可以得到
17、一个环加两个双键的数值。3由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先消去一个中性分子甲基后得到最稳定的140质量数的最高峰。同时根据Beynon表及其最小碎片质量数42的所有可能性可以得到该化合物只能含有不超过两个N原子。（1个）4对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。第42页/共74页第43页/共74页生物大分子分析第44页/共74页多电荷离子 指带有2个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子
18、。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。第45页/共74页第46页/共74页ESI 在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子。下图是典型的 ESI 质谱图，由一簇不同程度质子化的分子离子峰 组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两峰，由下列公式计算所含的质子数(n)和样品的分子量(M)。第47页/共74页1314+第48页/共74页川牛膝HPLCMS分析第49页/共74页tR=17.67min的色谱峰，一级质谱数据(ESI，MS其为含量最大的峰，结合杯苋甾酮(分子量为520.3)是
19、川牛膝的主要成分，推测该离子峰为杯苋甾酮分子加合一个甲酸根后形成的准分离子峰M+HCOO-。又其二级碎片图中有m/z=519.2，其应为杯苋甾酮分子失去一个质子形成的碎片离子峰M-H-。有m/z=501.4，这应是由于甾酮类物质中含有较多的羟基，其施加碰撞能后以水分子的形式失去而形成碎片离子峰M-H-H2O-。再结合其它的碎片离子与杯苋甾酮的结构相符，因此推断该化合物为杯苋甾酮。第50页/共74页tR=16.22min的色谱峰，一级质谱数据,结合川牛膝中成分b-b-胡罗卜苷的分子量(576.2)推测其是b b-胡罗卜苷分子失去一个质子而形成的准分子离子峰M-H-。再结合b b-胡罗卜苷的结构中
20、含有羟基以及其二级质谱的碎片离子531.2M-H-H2O-,513.0M-H-2H2O-,431.1、341.0、233.2，与b-b-胡罗卜苷的结构相符，因此推断该化合物为b-b-胡罗卜苷。第51页/共74页第52页/共74页第53页/共74页麻黄类生物碱HPLC-MS第54页/共74页第55页/共74页第56页/共74页 结合麻黄的正离子一级质谱全扫描图和麻黄中三对主要生物碱的分子量(151.1、165.1、179.2)，发现色谱峰均为被测物质加合一个质子后形成的准分子离子峰M+H+，说明麻黄生物碱类物质在电喷雾电离(ESI)条件下易得到质子而带正电荷。麻黄中的三对同分异构体为空间异构，因
21、此每对物质的二级质谱图是相同的。第57页/共74页由于麻黄中的三对同分异构体的分子结构比较相似，均含有烷基、羟基等，容易失去水分子、碳分子、烷烃等而形成相应的碎片离子峰。根据此规律，结合三对同分异构体麻黄碱的分子量对其成分推测如下：M/Z=152.1的分子离子峰，由其质谱数据(ESI.MS)M/Z：152.1M+H+、l34.1 M+H-H2O+、l 07.1 M+H-H2O-CH3-C+、89M+H-2H2O-CH3-C+，因此推断其为去甲基麻黄碱或去甲基伪麻黄碱。第58页/共74页m/z=166.l的分子离子峰，由其一级质谱数据m/z：166.1M+H+以及二级质谱碎片离子148.1；M+
22、H-H2O+、l35.1M+H-H2O-CH2+、124.1，推断其为麻黄碱或伪麻黄碱。m/z=180.1的 分 子 离 子 峰，由 其 质 谱 数 据 m/z：l62.2M+H-H2O+、l47.4M+H-H2O-CH2+、134.1M+H-2CH2+、l15.9M+H-CH2-NH4+、l03.1M+H-H2O-CH2-C+、88.8，推断其为甲基麻黄碱或甲基伪麻黄碱。第59页/共74页第60页/共74页第61页/共74页高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸 采用HPLC/MS/MS技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。直接进样实验。
23、清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（ESI）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰M-H-，再用二级质谱（MS/MS）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。第62页/共74页通过对样品进行分子离子峰的扫描发现MH的峰中有一个很强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为408）。如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。第63页/共74页检测硝基呋喃类代谢物第64页/共74页以第一步测得值为母离子，做PRO
24、DUCT ION SCAN（MS2），调节CE等参数，使母，子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择2个最高的子离子，分别为呋喃它酮AMOZ：M/Z 291，262；呋喃唑酮AOZ：M/Z 134，104；呋喃妥因AHD：M/Z 134，104或178；呋喃西林SEM：M/Z 192，166，第65页/共74页AMOZ第66页/共74页AMOZ-D5第67页/共74页AOZ第68页/共74页AHD第69页/共74页AHD内标（选252/134）第70页/共74页SEM内标（选212/195）第71页/共74页以第二步选定的离子对，例如335.1/262.2 等，做MRM SCAN。通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。接好色谱柱，编辑LC梯度洗脱，进样。用空白提取液配制同样浓度标样，按上一步方法进样。用空白提取液配制一系列不同浓度硝基呋喃代谢物标样，按上一步方法进样，例如，分别稀释为浓度0.25ug/kg,0.5ug/kg,1.0ug/kg,2.0ug/kg,4.0ug/kg,8.0ug/kg,等等。第72页/共74页按上述方法采集数据，做标准曲线,并进行硝基呋喃代谢物样品的测定。如果4种同位素内标齐全，则定量时一一对应计算，如只有AOZ-D4和AMOZ-D5，则1种内标可对应2种硝基呋喃代谢物。第73页/共74页感谢您的观看！第74页/共74页