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1、 目录3.1植物组织培养的方法3.2植物的试管繁殖 3.3植物细胞突变体的筛选及应用3.4植物细胞的大量培养及次生代谢产物的生产第1页/共66页3.1植物组织培养的特点3.11植物组织培养发展简史3.12植物组织培养实验条件与培养基3.13植物组织培养的一般方法3.14植物细胞的全能性和分化调控第2页/共66页植物组织培养植物组织培养无菌条件下，利用人工培养基对植物体的器官、组织和细胞进行培养。第3页/共66页3.11植物组织的发展简史植物组织的发展简史探索阶段（本世纪初30年代中）德国植物生理学家HaHerlandt首次进行了细胞培养实验奠基阶段（3050年代）1934年，White培养番茄
2、离体根尖成功。1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功。White:烟草种间杂种的瘤组织，进行组培。Nobecourt：胡萝卜进行组培，三人是植物组织的奠基人。迅速发展阶段（60年代后）原生质体，花药，微繁技术迅速发展。第4页/共66页3.123.12植物组培的实验条件和培养基植物组培的实验条件和培养基准备室：清洗区，干燥箱，工作台，水箱，天平，灭菌锅等。无菌操作室：超净工作台，可调节光 源，可调节温度培养室：保温隔热，光线合适培养操作器材：试管、三角瓶、玻 璃瓶、金属器材第5页/共66页一些设备第6页/共66页培养室培养室第7页/共66页培养基培养基定义：含有一定营养成分
3、，供组织培养植物生长的基质。无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素。有机营养成分 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的葡萄糖 琼脂：起支持作用。生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素PH值：5.06.0间一般，在每次进行植物培养前可利用母液自行配制所需培养基第8页/共66页常用培养基配方第9页/共66页一般方法第10页/共66页洗涤洗涤培养瓶和其它器皿应先在清水中浸泡后，然后刷去瓶内污物，再用洗衣粉、洗洁净等洗涤。洗净的器皿应不挂水珠，内外壁水膜均一，置于烘箱内烘干。第11页/共66页灭菌灭菌无菌操作是植物组织培养中最关键的技术！培养基应用高压灭菌锅灭菌121度15分钟灭菌一些
4、不耐热的物质将采用过滤灭菌，如生物添加剂、赤霉酸和玉米素等玻璃器皿及耐热用具用干热灭菌。植物材料先刷洗然后冲洗，再用消毒液，如次氯酸钠、升汞等进行表面灭菌，最后用蒸馏水清洗。第12页/共66页原代培养原代培养外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官。1）外植体灭菌消毒。（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上。3）切取所需的外植体。4）将外植体接种于培养容器的培养基上，整个试验在超净工作台上进行，保持无菌！外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织。第13页/共66页切取切取第14页/共66页接种接种第15页/共66页愈伤组织的形成愈伤组织的
5、形成脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程即形成愈伤组织叫脱分化。愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。再分化：愈伤组织内的细胞具有异质性，能重新分化成各种类型的组织细胞。第16页/共66页继代培养继代培养将愈伤组织重新转移到成分相同的新鲜培养基上的过程称为继代，愈伤组织将在不同的培养基上分化形成小芽或根，进而形成小苗。第17页/共66页试管苗的炼苗试管苗的炼苗当小苗生根成为完整的再生植株后，可以出瓶种植。由于环境有很大的改变，首先要进行炼苗，使之适应外界环境。1）开盖，保持小苗的水分供需平衡2）放置在与种植环境相一致的的光、温条件下；或降低温度，增加光照。3）防止
6、菌类滋生。第18页/共66页移栽移栽经过锻炼的小苗，可以和一般植物一样进行大规模栽培第19页/共66页意义意义1.无性系快速繁殖2.去除病毒、真菌和细菌等病毒3.培育新品种的得力手段4.种质资源的保存5.次生代谢物的生产第20页/共66页细胞的全能性细胞的全能性全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，除受精卵能发育成胚外，植物的体细胞，雌配子、雄配子体都能发育成胚。第21页/共66页细胞分化细胞分化在体内维管组织是高度分化的部分，主要受生长素和蔗糖的影响，木质部的分化与细胞分裂素、赤
7、霉素和细胞分裂相关。在体外的培养细胞通过茎芽的分化或细胞胚胎发生能再生长成为完整的植株第22页/共66页影响茎芽分化的因素影响茎芽分化的因素化学因素：促芽形成 细胞分裂素：BAP、6BA等促根形成 生长素：IAA、IBA、NHA、2，4D等物理因素：光照、温度、材料本身状态等都会影响茎芽的分化。第23页/共66页3.23.2植物的试管繁殖工艺流程3.21单倍体诱导形成及其应用3.22原生质体的分离和培养3.23体细胞胚胎发生3.24植物脱毒技术培养3.25植物人工种子的制作第24页/共66页单倍体培养单倍体培养单倍体：具有配子体染色体组成的孢子体；一般多指形成花粉的小孢子60年代：印度Guha
8、和Maheshwari进行花药培养，首次进行了单倍体培养。幼年植物的花药和花粉都能进行培养，形成花粉植株。第25页/共66页雄核发育雄核发育影响因子：1）营养因子：蔗糖等2）药壁因子：花粉壁内的物质3）花粉在接种时所处的发育时期4）温度和光照5）供体植株的生理状况：幼年植株较好第26页/共66页花药和花粉培养第27页/共66页花药培养花药培养第28页/共66页花粉培养（花药看护法）花粉培养（花药看护法）第29页/共66页雄核发育的四个途径第30页/共66页其它单倍体的途径其它单倍体的途径1）由未受粉的子房或胚珠培养诱导单倍体的形成2）利用远缘种杂交引起染色体消除以获得单倍体第31页/共66页高
9、等植物中单倍体的意义和应用高等植物中单倍体的意义和应用由于单倍体只有一套基因，隐性突变不受显性基因干扰，携带有利突变的单倍体一经发现，就可在一个世代内通过染色体加倍，成为表现有利突变的二倍体。应用：1）新品种培育2）加速纯系获得3）异源染色体或基因的转移4）突变体的选择及应用现状：成功主要局限于茄科，禾本科和十字花科第32页/共66页单倍体植株的二倍体单倍体植株的二倍体利用秋水仙素或组织创伤法可以将不育的单倍体转变成为可育的纯合二倍体第33页/共66页3.22原生质体的分离和培养原生质体的分离和培养原生质体：植物除去细胞壁分离剥下的部分利用原生质体可以进行细胞融合、摄取外源DNA，细胞器，细菌
10、或病毒颗粒。第34页/共66页分离分离1）机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割第35页/共66页2 2）酶解法）酶解法第36页/共66页原生质体培养原生质体培养第37页/共66页3.23植物脱毒培养技术植物脱毒培养技术1）无性繁殖作物，易感染病毒，造成品质下降。2）如何在一个已经受感染的群体中获得无病植株？a.种子繁殖b.消除病原菌3）消除病原菌的方法又是什么？a.热处理：热水或热空气。b.茎尖培养。c.愈伤组织培养。第38页/共66页茎尖及愈伤组织培养茎尖及愈伤组织培养茎尖：顶端分生组织及其下方13个幼叶原基一起构成茎尖一般无毒的原因是什么？培养基，外植体大小及生理状态，培养条件，都对
11、脱毒效果有影响愈伤组织中的部分细胞也可能无毒第39页/共66页3.243.24体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生体细胞胚：在离体或活体条件下，由除合子之外的孢子体细胞形成的胚。第40页/共66页体细胞胚胎发生的过程体细胞胚胎发生的过程胡萝卜悬浮细胞的体细胞胚胎发生过程图第41页/共66页影响体细胞胚胎发生的因子影响体细胞胚胎发生的因子生长调剂物质：诱导培养基 在浓度为0.51mg的含有2，4D生长素的培养基上，愈伤组织会分化形成胚性细胞团。如将胚性细胞团转移到一种生长素很低的的培养基上，会发育成成熟的胚。氮源：NH 4，NO3其它因子：高钾等第42页/共66页人工种子人工种子利用人工种皮包被体细胞胚
12、可以制造人工种子，用以繁殖遗传工程植物，减速分裂不稳定的基因型，自交不亲合植物，稀有植物，远缘杂交种等人工种皮：藻酸钠第43页/共66页制作过程：体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中，分钟后，表面络合，形成人工种子第44页/共66页3.33.3植物细胞突变体的筛选及应用植物细胞突变体的筛选及应用3.31诱变方法3.32变异体的分离与鉴定3.33变异体细胞的应用潜力第45页/共66页用组织培养进行突变研究的意义用组织培养进行突变研究的意义可以在比田间试验小得多的空间和较短的时间内，用人工控制的环境对单倍体、二倍体和多倍体细胞进行大量的基因组操纵，在植株水平回收所发生的遗传修饰。细胞
13、水平上选择出的变异不一定在再生植株水平上表达。体细胞无性系变异：未受过选择压力之组织培养物，其再生植株出现遗传变异第46页/共66页诱变诱变突变分类：自发突变和诱发突变继代过程中会发生染色体的变异。自发突变的频率低，一般在100万次细胞分裂中才发生一次。诱发突变利用诱变剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、N甲基N硝基N亚硝基胍（MNNG）、紫外线、X射线等，可以增加活细胞中的变异型。注意：化学诱变剂一般有毒且致癌。诱变材料多用原生质体和胚。第47页/共66页变异体的分离和鉴定突变体的步骤变异体的分离和鉴定突变体的步骤1）分离营养缺陷型或温度敏感变异体负选择法：即在特定的培养条件下，选择出其生长受限制的
14、那些细胞全数分离法：花药培养产生单倍体植株原生质体分、培养和诱变用全数分离法分离一个个单个的集落并试验负选择鉴定变异系的专一性和重现性鉴定变异系的稳定性再生植株作遗传学分析。2）分离抗性变异体和鉴定突变体的一般步骤直接选择法：即把细胞置于有毒的化合物（选择剂）协迫下，敏感的细胞不能生长而抗性细胞能够生长从而分离出来。第48页/共66页筛选出的变体异品种筛选出的变体异品种1.营养缺陷型：需泛酸、腺嘌呤、异亮氨酸等2.抗氯酸盐3.抗氨基酸或氨基酸类似物4.抗抗菌素药物：如抗链霉素的烟草突变体5.抗除草剂：如一种烟草的变异体6.抗病的：如玉米，马铃薯的变异体另外：还有抗核酸碱基类似物的烟草突变植物，
15、耐热，耐旱，抗重金属离子，温度敏感的变异体等。第49页/共66页突变细胞系的意义突变细胞系的意义1）可作为遗传学和遗传工程研究的好材料如：为遗传研究提供适用的选择标志，分析控制性状的突变基因，识别特点基因，定向诱变等2）了解代谢和发育过程及其调节3）利用有益突变，获得实用价值的新类型第50页/共66页3.43.4植物细胞的大量培养及次生代谢产物的生长l3.41植物悬浮细胞系l3.42大规模植物细胞培养系统l3.43影响次生代谢物质产量的因素第51页/共66页3.413.41植物悬浮细胞系植物悬浮细胞系利用悬浮培养可实现大规模培养，获得细胞，初级及次级代谢产物，为药品，食品及化工行业提供服务。培
16、养基：B5和ER，但没有琼脂，其中无机磷是限制因子。分类：分批培养和连续培养悬浮培养应在摇床或转床上进行振动，大多数摇床的转速为30150转/分，冲程23cm。第52页/共66页分批培养分批培养把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培养物。一般使用100250ml的三角烧瓶，每瓶装有2075ml的培养基。为使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代培养。进行继代培养时可用吸管或注射器，但其困境必须只允许通过单细胞或小细胞团（24个）细胞的生长曲线第53页/共66页连续培养连续培养利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式封闭型连续培养：新培养基补充旧培养基，在培养容器中
17、细胞数目上升开放型连续培养：新培养基补充的量和流出的旧培养基和细胞的量相等，培养容器内细胞数目恒定。化学恒定式：以固定速度注入的新鲜培养基内的某种选定营养成分的浓度被调节成为一种生长的 限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定浊度恒定式：预先选定一种细胞密度，当超过这个密度时细胞随培养液一起排出，同时注入新鲜培养液，保持细胞浓度。第54页/共66页大多数的培养细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。利用饥饿法或抑制法实现饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。抑制法：
18、使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、FUdR、羟基 和胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。同步培养：同步培养：第55页/共66页悬浮培养中细胞生长量的计算悬浮培养中细胞生长量的计算1）细胞计数：血球计数板 注意：事先用酶液将细胞团分开2）细胞密实体积（PCV）将一已知体积的均匀分散的悬浮液放入一个15ml刻度离心管中，在200g下离心5min。细胞密实体积是以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数来表示的。3）细胞鲜重把悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤除去水分称重4）细胞干重用已知重量的干尼龙丝网依上法收集细胞，在60度下干燥12h，再称重，以每毫
19、升培养物或每106 个细胞的重量表示的。第56页/共66页细胞活力测定细胞活力测定1）相差显微法：细胞质环流和正常细胞核的存在。2）四唑盐还原法：通过2，3，5-氯化三苯基四唑（TTC）还原成红色染料甲 ，可以测定细胞的呼吸效率。3）FDA法：可以对活细胞百分数进行快速的目测。4）伊凡蓝染色法：做FDA的互补法。只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料，凡不染色的细胞皆为活细胞。第57页/共66页大规模植物培养的系统大规模植物培养的系统悬浮培养系统成批培养：根据分批培养原理，采用平叶轮培养半连续培养：在反应器中，投料和接种培养，一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养。连续培养：连续培
20、养反应器，在投料和接种培养后，以一定速度连续采集细胞与培养液，以同样速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长环境长期维持稳定 第58页/共66页采用网状多孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式，将细胞固定于尼龙网套内，装入填充床，或固定于中空纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，使细胞处于既有梯度分布，又有多个生长点的反应器中，投入培养液循环培养，或连续流入新鲜培养液，实现连续培养和连续收集培养产物，必要时也通人净化空气而代替搅拌的培养方式。固定化培养系统：固定化培养系统：第59页/共66页有用次生代谢物质第60页/共66页影响次生物质产量的因素影响次生物质产量的因素第61页/共66页提高次生代谢产物的方法提高次生代谢产物的方法1）掌握最佳的操作条件2）了解调节细胞中次生物质代谢途径和方式3）材料的选择上要注意突变体，遗传型等第62页/共66页本章小节本章小节3.1植物组织培养的方法3.2植物的试管繁殖 3.3植物细胞突变体的筛选及应用3.4植物细胞的大量培养及次生代谢产物的生产第63页/共66页参考书目参考书目1）植物组织培养教程 李骏明 中国农业大学出版社2）植物细胞培养手册奚元龄 等 农业出版社 3）观赏植物组织培养技术 谭文澄等 中国林业出版社4）植物原生质体培养 孙勇如等 科学出版社第64页/共66页第65页/共66页感谢您的观看！第66页/共66页