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1、红豆杉（Taxus）第1页/共30页红豆杉种类：全世界11种（北半球）。我国4种一变种：东北红豆杉、（中国）红豆杉、云南红豆杉、喜马拉雅红豆杉（西藏红豆杉）、南方红豆杉（中国红豆杉的变种紫杉醇含量：干树皮重0.01%（万分之一）数量：稀少，散生、不成林生长：极为缓慢，50-70年成树紫杉醇：资源稀缺第2页/共30页云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉第3页/共30页对细胞系进行持续选择：细胞系在培养工程中，细胞系会出现变异，通过持续选择，有可能不断提高细胞系的生产能力。大量的试验证实了这一点。云南红豆杉细胞系黄白色细胞深褐色细胞颜色含水量生长速度分泌物质第4页/共30页云南红豆杉
2、细胞系统选择的结果第5页/共30页植物种类植物种类代谢物代谢物整株植物整株植物（%）细胞培养细胞培养物（物（%）长春花长春花长春碱长春碱0.00170.005长春花长春花蛇根碱蛇根碱2.0栗米栗米草莽草酸草莽草酸10紫草紫草紫草素紫草素1-215-20人参人参人参皂甙人参皂甙0.52.2黄连黄连小檗碱小檗碱2-413.4洋紫苏洋紫苏迷迭香酸迷迭香酸3.016云南红豆杉云南红豆杉紫杉醇紫杉醇0.020.11中国红豆杉中国红豆杉紫杉烷紫杉烷(Sinenxan)微量微量7-11=1500mg/L第6页/共30页Sinenxan A：R=Ac Sinenxan B：R=CH3CH2COSinenxan
3、 C：R=CH3CH2CH(CH3)CO紫杉烷Baccatin III的结构（紫杉醇的母核）紫杉烷Sinenxan的结构 紫杉醇Taxol第7页/共30页细胞诱变选择细胞系：如Deus用X射线处理长春花细胞，获得了蛇根碱含量达2%的细胞系；Berlin等用化学诱变烟草细胞，获得了生产肉桂酰腐胺能力提高了10倍的细胞系。细胞系遗传改良：利用基因工程技术超量表达限速酶基因、阻断分支代谢基因表达，从而提高细胞系合成次生代谢产物能力。代谢工程第8页/共30页（2）优化培养基（次生代谢物的产量=细胞生长量细胞合成代谢物的能力）基本培养基基本培养基细胞产量细胞产量(g DW/L)蛇根碱蛇根碱(mg/L)蛇
4、根碱含量（蛇根碱含量（%DW）Blaydes7.64.40.06LS9.300MS8.910.40.12N-N2.32.00.09VM5.000White 0.800B5 5.100B5+2,4-D1mg/L14.60.50.01B5+2,4 D 2 mg/L5.200B5+NAA 1.86 mg/L7.61.20.02Heller+IAA0.175+BA1.13 mg/L5.46.60.12第9页/共30页基本培养基：不同的基本培养基对细胞生长和次生代谢物的合成影响很大。基本培养基中N和P的浓度高往往有利于生长，但不利于次生代谢物的合成。植物激素：植物激素对次生代谢物生产的影响非常复杂。一般
5、2,4-D促进细胞生长，但抑制代谢物的合成。如在有2,4-D存在时，长春花、蔓陀萝、天仙子、罂粟等细胞不能合成生物碱，鸡眼藤不能合成蒽醌。紫草细胞培养时，IAA能促进紫草素的合成，而NAA，2,4-D则抑制其形成。但高浓度的2,4-D却能促进烟草中泛醌-10的合成。第10页/共30页（3）饲喂前体物质（precursor）药物有效成分生物合成途径中的中间物质。添加前体物质是提高次生代谢物产量的一个有效方法。如紫杉醇（Taxol）：紫杉醇结构可以分为母核（baccatin III）和侧链2部分,侧链则是由苯丙氨酸与苯甲酸形成的；Baccatin III是二萜类化合物，而二萜类化合物的生物合成途径
6、已经基本明确。第11页/共30页紫杉二烯单萜化合物C10倍半萜化合物C15其它二萜化合物异戊二烯乙酰辅酶A牻牛儿醇法呢儿醇牻牛儿醇基牻牛儿醇第12页/共30页 试验证明，向培养基中添加紫杉醇合成的前提物质（牻牛儿醇、牻牛儿醇基牻牛儿醇苯甲酸、苯丙氨酸等）可以使红豆杉细胞中紫杉醇含量提高3-5倍；向鬼臼细胞培养基中添加前提物质使鬼臼毒素含量提高12倍。第13页/共30页（4）使用诱导子（elicitor）诱导子是指能刺激细胞合成次生代谢产物的物质。诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指微生物，特别是致病微生物（活菌、高温灭菌后的菌物或其匀浆物）、微生物多糖等；非生物诱导子是指重金属离
7、子（Ag+,V2+,Hg2+,Cu2+）或Ca2+等。诱导子一般是在细胞培养的中后期（接近细胞最大生长期）加入。第14页/共30页第15页/共30页化合物化合物植物细胞植物细胞诱导前产量诱导前产量诱导后产量诱导后产量生物碱生物碱罂粟罂粟2.9 mg/L78 mg/L黄酮黄酮芸香芸香0.01 mg/L0.5mg/L棉酚棉酚棉花棉花2.0 mg/L200 mg/L皂素皂素薯蓣薯蓣130 mg/L230mg/L紫杉醇紫杉醇红豆杉红豆杉2.5 mg/L5.5mg/L第16页/共30页（5）改善培养条件光照：光照可以刺激长春花细胞合成蛇根碱、银杏细胞合成黄酮，却抑制黄连细胞中小檗碱、红豆杉细胞中紫杉醇的
8、合成温度：长春花和骆驼蓬细胞的最佳生长温度分别是27和30，但合成生物碱的最佳温度是分别是16和25。但胡萝卜在25和28时细胞合成花色素的能力无差异。PH值：雷公藤细胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0时最强；番薯细胞合成色醇的能力在pH6.3时最大，在pH4.8时则不能合成；胡萝卜细胞合成花色素的能力在pH4.5时最强，提高pH值则导致合成能力下降。第17页/共30页（6）改进培养方法两步培养法：细胞生长与有效成分合成所需要的条件往往不同、不同步，有效成分的合成与积累落后于生长。在前期促进细胞生长，在后期促进合成，从而兼顾细胞的生长量和次生代谢物的合成，达到提次生代谢物产量的目的。第18页/
9、共30页云南红豆杉细胞生长与紫杉醇含量动态紫杉醇含量生长量第19页/共30页第20页/共30页两相培养法：根据化学反应平衡原理知道，产物的积累会抑制化学反应正方向的速度（反馈调节），还可能会对细胞生长有毒害；移去产物则可以促进化学反应朝正方向进行。因此，如果将产物富集起来、与细胞体系相对隔离，就有利于产物的合成。两相培养可以解决这个问题。第21页/共30页两相培养法有2种方式。液固培养:液相是细胞和液体培养基，固相是能吸收药物成分的物质，如树脂、活性炭等。液-液培养:一层液相是细胞和液体培养基，另一层液相是能溶解次生代谢物的有机溶剂（如乙酸乙酯）。这2种方法都可以减少培养基中有效成分浓度，防止
10、负反馈调节，从而提高代谢物的产量。香竺葵细胞两相培养（液-液培养）：倍半萜的产量提高了500倍。第22页/共30页土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤。三、植物基因工程与生物制药三、植物基因工程与生物制药植物基因工程：植物基因工程：把外源基因导入植物细胞、获得能表达外源基因的植株，从而改变植物的性状。1983年第一个转基因植物转基因烟草第23页/共30页 根癌农杆菌引起的植物肿瘤第24页/共30页 农杆菌含有Ti质粒,Ti质粒中有一端可以转移的DNA(transfer DNA,
11、T-DNA),T-DNA含有生长素和细胞分裂素合成酶基因。农杆菌可以把T-DNA 转到植物细胞的染色体上(基因组 DNA)，生长素和细胞分裂素合成酶基因表达提高了细胞中生长素和细胞分裂素含量,促进细胞分裂,形成肿瘤。Ti质粒T-DNA农杆菌第25页/共30页第一步：获得目的基因、构建基因表达盒基因表达盒的结构为：终止子目的基因植物基因表达的结构植物基因表达的结构启动子CaMV35S基因的polyA;农杆菌胭脂碱基因的Tnos原核生物和真核生物的启动子植物基因工程的步骤第26页/共30页35S 启动子控制的GUS基因在烟草中表达茎叶片横切面根花幼苗启动子：位于结构基因5端上游、能够指导RNA聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。组成型启动子：在所有细胞、组织、器官中持续发挥作用的启动子。常用的有花椰菜花叶病毒35S启动子（CaM35S）、植物看家基因（actin基因、Ubiquitin基因等）启动子。第27页/共30页特异启动子：只在特定的组织或者器官（根、叶片、花器官、花粉、种子等）中起作用的启动子 拟南芥 pyk10根启动子第28页/共30页水稻胚乳水稻胚乳特异启动子特异启动子Qu L Q et al.J.Exp.Bot.2008;59:2417-2424 2008 The Author(s).第29页/共30页感谢您的观看！第30页/共30页