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1、食品毒理学 第七章 化学毒物的生殖毒性第1页，共24页，编辑于2022年，星期三一、雄性生殖细胞的发生过程一、雄性生殖细胞的发生过程精子的发生过程是指精原细胞发育成为成熟精子的过程。精子的发生过程始于胎儿期的原始生殖细胞。出生后，原始生殖细胞分化成精原细胞，后者直至青春期以前再曲细精管中处于休止状态。在青春期，在脑垂体促性腺激素的作用下，开始增殖，进行有丝分裂，形成两个单倍体的次级精母细胞，再经第二次成熟分裂，形成四个单倍体的精子细胞，精子细胞再经过一系列形态学变化成为具有特殊形态的成熟精子。随后由间质细胞包裹释放入输精管内，移入附睾后进一步成熟，成为具有受精能力和活动力的精子，进入精囊并在此
2、贮存。精子发生过程是在神经内分泌的精密调控下进行的。第一节第一节 雄性生殖毒性雄性生殖毒性第2页，共24页，编辑于2022年，星期三一、雄性生殖细胞的发生过程一、雄性生殖细胞的发生过程表7-1 外源化学物作用时间与精子发育阶段受作用时精子发育阶段从给药到精子成熟经历的时间/周小鼠大鼠输精管和附睾内的精子112后期精细胞23次级精细胞345次级精母细胞468初级精母细胞568精原细胞69第3页，共24页，编辑于2022年，星期三（一）对睾丸生精细胞的影响（一）对睾丸生精细胞的影响1.棉酚 长期食用粗制棉子油睾丸生精上皮丢失睾丸内精子、精细胞和精母细胞受损精子细胞的顶体肿胀、分离与碎裂精子中段的线
3、粒体螺旋鞘排列紊乱、嵴目减少通过葡萄糖和果糖代谢障碍抑制精子活力精子减少、不育2.工业污染物二硫化碳睾丸损害、精子生产障碍3.铅、镉、汞、锰等重金属精子减少4.多种农药精子减少、畸形、性功能减退二、外源化学物的雄性生殖毒性二、外源化学物的雄性生殖毒性第4页，共24页，编辑于2022年，星期三（二）对内分泌功能的影响（二）对内分泌功能的影响睾丸的功能受垂体前叶分泌的促性腺激素的调节，而垂体分泌的促性腺激素又受下丘脑产生的促性腺释放激素的调节。精子的生成是在神经分泌的精密调节和控制下进行。重金属铅可干扰下丘脑垂体睾丸轴的正常功能，主要是影响促性腺释放激素（GnRH）的释放，表现为卵泡刺激素（FSH
4、）、黄体生成激素（LH）、睾酮含量降低。最终造成精子减少，活力减弱，性欲减退等。二硫化碳亦可导致睾酮减少、精子生成障碍等。第5页，共24页，编辑于2022年，星期三（三）对性功能和生殖功能的影响（三）对性功能和生殖功能的影响外源化学物（化学毒物）如果造成生殖系统任何一个环节的异常，则表现出雄性不育，即雄性性功能障碍。如铅、镉、汞、锰等重金属。第6页，共24页，编辑于2022年，星期三（一）精子生成分析（一）精子生成分析（1）精子计数数目减少量确定有无毒害作用发生（2）精子形态观察头尾部的形态改变（3）精子状态分析试验静夜的pH、液化时间，精子运动能力，蛋白质、脂质和微量元素的含量等是否与外源化
5、学物有关三、雄性生殖毒性的检测方法三、雄性生殖毒性的检测方法（二）精子穿透试验（二）精子穿透试验即精子体外受精实验，是检测精子在体外能否成功穿透去透明带的金黄地鼠卵子而受精的试验，为综合评价外源化学物对人类精子受精能力的影响、探明雄性不育提供科学依据。第7页，共24页，编辑于2022年，星期三（三）睾丸中标志酶活性的测定（三）睾丸中标志酶活性的测定临床和动物试验中常检测乳酸脱氢酶同工酶x、山梨醇脱氢酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶的变化，并结合精子生成过程中各阶段细胞的功能和形态学改变，即可评价外源化学物的生殖毒性，并有可能探明毒性作用部位和机理。（四）体外试验（四）体外试验体外试验主要是将哺乳动物的生
6、殖细胞在体外条件下进行培养，并与受试外源化学物接触，观察生殖细胞的变化。通过支持细胞和间质细胞等体外分离培养，测定支持细胞的乳酸含量和乳酸脱氢酶活性的变化以及测定间质细胞分泌的雄激素含量来判断外源化学物是否对所培养细胞的功能有影响。亦可分离上述细胞，通过细胞计数和形态学检查的方法来判断。第8页，共24页，编辑于2022年，星期三（五）雄性激素检测（五）雄性激素检测雄性生殖系统无论生精过程、精子成熟过程，还是附属性腺的分泌活动，都需要有足够的睾酮，通过检测FSH、LH和睾酮的含量变化来判断外源化学物是否对雄性生殖产生影响。检测上述三种性激素含量有助于生殖毒性的评价以及生殖毒作用机制的探讨。（六）
7、显性致死试验（六）显性致死试验显性致死试验是通过给予雄性动物受试化学物，将其与未经受试物处理的雌性动物交配，观察雌性动物早期胚胎死亡情况，以评价受试物是否对雄性动物的生殖有损害作用的试验。本方法系采用哺乳动物进行试验，较接近人体实际情况，主要观察指标为胚胎早期死亡，即观察子宫中活胎、死胎及吸收胎等书目，易于观察，实验技术容易掌握，不需要复杂的试验条件。缺点是不够灵敏。第9页，共24页，编辑于2022年，星期三（七）雄性生殖细胞遗传毒性检测（七）雄性生殖细胞遗传毒性检测传统检测方法：小鼠睾丸染色体畸变分析试验、小鼠精子畸变分析试验、黑腹果蝇染色体性阴性分析试验新方法：单细胞凝胶电泳试验（彗星试验
8、）原理：细胞在体内和体外试验中受化学物作用后，DNA链发生断裂。将细胞制成单细胞混悬液，在载玻片上制备加有受检细胞混悬液的凝胶，载碱性条件下使细胞裂解，解旋DNA后进行电泳。带负电荷的DNA断裂端由阴极向阳极迁移。DNA经EB染色后在荧光显微镜下可观察到DNA受损的细胞核拖一条尾巴，呈彗星状，如DNA无损伤则见圆形的核。（八）雄性生殖毒性病理检查（八）雄性生殖毒性病理检查睾丸、附睾、前列腺已经精囊的重量和大小的改变常是接触有害化学物的明显特征。睾丸组织易受外来化学毒物的侵害，因此在亚慢性或慢性动物毒性试验中，睾丸组织形态检查是一项重要的观察指标。解剖观察是生殖病理检验的主要环节，是雄性生殖毒理
9、学研究中不可缺少的较为敏感的指标和重要手段。第10页，共24页，编辑于2022年，星期三一、雌性生殖细胞的发生过程一、雌性生殖细胞的发生过程雌性生殖系统由卵巢、输卵管、子宫和外生殖器等组成。卵泡（包括卵细胞、包裹的颗粒细胞和膜细胞）的发育是一个连续变化的过程，一般可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡四个阶段。卵巢的周期性变化育动情周期密切相关。初级卵母细胞进一步成熟并发育至次级卵母细胞，需垂体下叶分泌的FSH和LH的作用。第二节第二节 雌性生殖毒性雌性生殖毒性第11页，共24页，编辑于2022年，星期三（一）对卵细胞的影响（一）对卵细胞的影响研究表明，卵细胞发育到排卵前阶段即第一次减数
10、分裂的终变期和中期对化学毒物最敏感。如镉，NIH雌性小鼠皮下一次注射氯化镉1、3、6mg/kg后，排卵能力明显受抑制，排卵数目随剂量增加而减少，呈明显的剂量反应关系。镉可能直接进入到卵细胞内并损伤其遗传物质。镉金属硫蛋白中Zn2+二硫化碳不仅对多种动物的睾丸有毒性作用，而且对雌性动物性腺、胚胎也有损害作用，可影响卵巢，使动物的动情周期发生改变，受孕能力降低，影响受精卵和胚胎的正常发育。二、外源化学物的雌性生殖毒性二、外源化学物的雌性生殖毒性第12页，共24页，编辑于2022年，星期三（二）对内分泌功能的影响（二）对内分泌功能的影响卵巢的功能和生殖周期受体内内分泌系统的调节，即通过下丘脑垂体性腺
11、轴。外源化学物可影响上述任何一个环节而对雌性生殖产生损害作用。苯及其同系物在一定剂量下会造成雌性的生殖功能损害，该类化学物直接干扰下丘脑，作用于垂体卵巢系统，使内分泌调节系统异常，而导致月经异常，同时抑制卵巢功能使绝经期改变。林丹、开蓬等有机氯农药，可使雌性动物阴道开启和排卵周期延迟，甚至停止排卵，以及死胎和自然流产等。（三）其它毒性作用（三）其它毒性作用亦可表现在子代，造成畸形、死胎、功能发育不全等。各种生殖功能毒性作用在整个生命过程的不同阶段都可出现，这充分说明雌性生殖毒性的复杂性。第13页，共24页，编辑于2022年，星期三三、雌性生殖毒性的检测方法三、雌性生殖毒性的检测方法（一）体外试
12、验（书上表7-2）体外试验对于阐明化学毒物的毒性作用机理具有重要意义。但目前尚不能完全替代整体动物试验。（二）动物试验整体动物试验仍为主要评价方法，常用的方法有两类：一类为一代繁殖试验或多代繁殖试验和致畸试验；另一类为三阶段生殖试验。（三）其它辅助试验雌性动物动情周期观察、排卵观察、雌激素水平测定、病理组织学测定等。第14页，共24页，编辑于2022年，星期三第三节第三节 致畸试验致畸试验能引起妊娠的人或试验动物产生畸胎的外源化学物称为致畸物。它通过胎盘直接作用于发育的胚胎和胎儿而产生后果。通过动物试验和体外致畸试验方法，可检测外源化学物能否引起胚胎毒性或后代畸形。第15页，共24页，编辑于2
13、022年，星期三一、动物致畸试验（一、动物致畸试验（1 1）（一）基本原理致畸试验是检查受试外源化学物能否通过妊娠母体引起毒性或后代畸形的动物试验。通过致畸试验可以确定一种受试物是否具有致畸作用。胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射性物质的作用，使细胞分化、器官形成和正常发育收到阻滞，以致出现胎仔器官的器质性缺陷而呈现畸形。因此，可以通过观察妊娠母体在敏感期接触受试物后胚胎及胎仔的发育状况来评价某种外源化学物有无致畸作用。第16页，共24页，编辑于2022年，星期三一、动物致畸试验（一、动物致畸试验（2 2）（二）基本方法（1）动物选择参照毒性试验中选择动物的一般原则及妊娠期较短而一致、产仔
14、数多、胎盘结构与人类接近、自发畸形率较低大鼠小鼠/家兔（2）动物交配处理（3）剂量分组（关键）要求出最大无作用剂量以及引起致畸的阈剂量、且要保持母体生育能力（4）动物剖检预期分娩前12d处死母体（防自食）（5）胎仔检查（三）结果判定方法在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。在计算畸胎总数时，每一活胎仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。在计算畸形总数时，同一胎仔出现一种畸形作为一个畸形计算，出现两种或两个畸形，则作为两个畸形计算，依此类推。第17页，共24页，编辑于2022年，星期三二、体外致畸作用试验二、体外致畸作用试验体外致畸试验的方法很多，主要有体外全胚培养、器官培养和细胞
15、培养三个层次的试验。体外致畸试验的优点是：1）可以节约大量人类和时间，方法快速；2）可利用人类的血清、尿液进行试验，便于直接观察受试物对接触人群的作用；3）可利用单加氧酶或线粒体等酶观察外源化学物在体内的代谢转化过程对其致畸作用以及发育毒性的影响；4）容易严格控制试验条件，有可能排除母体中一些其它干扰因子和母体对致畸原的影响，有利于致畸作用剂量的探讨。第18页，共24页，编辑于2022年，星期三第四节第四节 繁殖试验繁殖试验繁殖试验的目的在于了解外源化学物对机体整个生殖过程以及对子代是否产生毒性作用。通过繁殖试验即可了解外源化学物对动物性功能、交配行为、受精能力、分娩、授乳等过程的影响。第19
16、页，共24页，编辑于2022年，星期三一、试验方法（一、试验方法（1 1）（一）试验动物多选用健康刚断乳大鼠。每组用20只雌鼠，10只雄鼠。（二）染毒剂量及分组设对照组、高剂量组（为90d或长期毒性试验的最大无作用剂量）、低剂量组（可以采用最大无作用剂量的1/30或人类可能摄入量的100倍）。必要时增设中间剂量组。接触途径与人类实际接触的途径相同。（三）试验步骤试验动物按设计剂量先给予受试物90d，性成熟后即可按常规方式交配，所生仔鼠为第一代（F1）。每代交配两次，第一次生仔（F1a）断乳后10d再使亲代进行第二次交配，生仔为（F1b）。即第一代为F1a和F1b。其余各代依此类推。第20页，共
17、24页，编辑于2022年，星期三二、观察指标二、观察指标（1）交配指数（2）受精指数（3）受孕率（4）正常分娩率（5）活产率（6）妊娠率（7）出生存活率（8）哺乳存活率三、结果判定三、结果判定将试验组动物各项观察指标统计结果与对照组动物进行比较，乳试验动物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔发育（哺育）等方面收到影响，则说明受试物对动物繁殖功能有损害作用。第21页，共24页，编辑于2022年，星期三第五节第五节 胚胎毒性胎儿动脉管畸形的研究方法（胚胎毒性胎儿动脉管畸形的研究方法（1 1）胚胎毒性作用指外源化学物对母体子宫内发育的胚胎或胎儿产生的毒性作用。由外源化学物引起的胚胎毒性具体表现在以下几个方面
18、：（1）胚胎死亡（危害最大）（2）生长发育迟缓（3）胎儿先天缺陷和畸形（危害大，研究重点）（4）功能发育不全第22页，共24页，编辑于2022年，星期三第五节第五节 胚胎毒性胎儿动脉管畸形的研究方法（胚胎毒性胎儿动脉管畸形的研究方法（2 2）胎儿动脉管是直接把胎儿肺动脉连接到大动脉的辅助通路。是在母体内见不到的独特的血管。在胎生期内动脉管承担着重要的循环作用。动脉管随着妊娠末期的接近，徐徐增大其内径，胎儿出生后，随着肺呼吸的开始，动脉管又引起收缩闭锁，以索状组织残存在体内。动脉管在胎生期内，如果受到某种因素，如药品、农药等影响引起收缩，则胎儿在出生为止可引起持续性地肺高血压症。胎儿出生后，由于某种原因引起胎儿动脉管的收缩闭锁，也可引起胎儿动脉管的开放症。又外源化学物引起的胚胎毒性胎儿动脉管畸形（收缩）的研究方法，常用将大鼠胎儿固定于急速冻结台后切割观察法。如果外源化学物对胎生期的特殊血管动脉管产生毒性，则可观察到胎儿动脉管内景显著收缩的现象。第23页，共24页，编辑于2022年，星期三课堂练习课堂练习1.什么是生殖毒性？2.雄性生殖毒性的检测方法有哪些？3.什么是胚胎毒性作用？第24页，共24页，编辑于2022年，星期三