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1、发酵工程第1页，共60页，编辑于2022年，星期六第一节第一节 工业发酵生产菌种工业发酵生产菌种一、工业发酵微生物及其代谢产物一、工业发酵微生物及其代谢产物(一一)微生物代谢产物的类型微生物代谢产物的类型1初级代谢产物初级代谢产物2次级代谢产物次级代谢产物第2页，共60页，编辑于2022年，星期六初级代谢初级代谢初级代谢初级代谢主要主要是指把营养物质转化为机体结构和生理是指把营养物质转化为机体结构和生理活性物质以及提供能量的代谢作用活性物质以及提供能量的代谢作用。微生物通过初级代谢途径，产生微生物通过初级代谢途径，产生微生物通过初级代谢途径，产生微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所
2、必需微生物自身生长繁殖所必需微生物自身生长繁殖所必需微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物的代谢产物的代谢产物的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。，这些产物称为初级代谢产物。，这些产物称为初级代谢产物。，这些产物称为初级代谢产物。初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间代谢物、前体物、高分子物质以及能量代谢和代谢调代谢物、前体物、高分子物质以及能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核酸等。多糖和核酸等。第3页，共60页，编辑于2022年，星期六次级代谢是微生物在一定的生理阶
3、段出现的次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免某些微生物为了避免在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型型，次级代谢产物通常是在，次级代谢产物通常是在生长后期合成生长后期合成。次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，如如抗生素、生物碱、色素、激素和毒素抗生素、生物碱、色素、激素和毒素等。等。第4页，共60页，编辑于2022年，星期六（二）工业发酵常见微生物及其代谢产物（二）工业发酵常见微生
4、物及其代谢产物1、细菌及其代谢产物、细菌及其代谢产物2、放线菌及其代谢产物、放线菌及其代谢产物3、霉菌及其代谢产物、霉菌及其代谢产物4、酵母及其代谢产物、酵母及其代谢产物第5页，共60页，编辑于2022年，星期六二、工业发酵对生产菌种的一般要求二、工业发酵对生产菌种的一般要求原料廉价易得，代谢产物产量高。原料廉价易得，代谢产物产量高。对培养条件对培养条件(糖浓度、温度、糖浓度、温度、PH、溶解氧及、溶解氧及渗透压等渗透压等)要求不高，易于控制，酶活性高。要求不高，易于控制，酶活性高。特别是在华南地区建厂，夏季气温炎热，应选择耐高特别是在华南地区建厂，夏季气温炎热，应选择耐高温的菌种。温的菌种。
5、第6页，共60页，编辑于2022年，星期六所选菌株生长速度和产物生成速度应较快，所选菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。发酵周期较短。根据代谢控制的要求，选择单产高的营养根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。株。不易被噬菌体感染。不易被噬菌体感染。不易变异退化。不易变异退化。二、工业发酵对生产菌种的一般要求二、工业发酵对生产菌种的一般要求第7页，共60页，编辑于2022年，星期六三、工业发酵生产菌种来源三、工业发酵生产菌种来源1、自然选育（需要通过菌种改良即菌种选育、自然选育（需要通过菌种改良即菌种选育才能得
6、到符合工艺要求的菌种）。才能得到符合工艺要求的菌种）。2、从菌种保藏机构获得。、从菌种保藏机构获得。3、从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变、从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种。的优良菌种。第8页，共60页，编辑于2022年，星期六第二节第二节 生产菌种的选育生产菌种的选育一、自然选育一、自然选育二、诱变育种二、诱变育种三、杂交育种三、杂交育种四、基因工程育种四、基因工程育种第9页，共60页，编辑于2022年，星期六一、自然选育一、自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，用菌种的自发突变而进行菌种筛选的
7、过程，称为称为自然选育或自然分离自然选育或自然分离。第10页，共60页，编辑于2022年，星期六1、分离思路、分离思路 新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。速、准确地把所需要的菌种挑选出来。第11页，共60页，编辑于2022年，星期六定方案：定方案：定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性
8、。采样：采样：采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。增增增增殖殖殖殖：人人人人为为为为地地地地通通通通过过过过控控控控制制制制养养养养分分分分或或或或培培培培条条条条件件件件，使使使使所所所所需需需需菌菌菌菌种种种种增增增增殖殖殖殖培培培培养养养养后后后后，在数量上占优势。在数量上占优势。在数量上占优势。在数量上占优势。分离：分离：分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：进进进进行行行行生生生生产产产产性性性性能能能能测测测测定定定
9、定。包包包包括括括括形形形形态态态态、培培培培养养养养特特特特征征征征、营营营营养养养养要要要要求求求求、生生生生理理理理生生生生化化化化特特特特性性性性、发发发发酵酵酵酵周周周周期期期期、产产产产品品品品品品品品种种种种和和和和产产产产量量量量、耐耐耐耐受受受受最高温度、生长和发酵最适温度、最适最高温度、生长和发酵最适温度、最适最高温度、生长和发酵最适温度、最适最高温度、生长和发酵最适温度、最适pHpHpHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。2、新种分离与筛选的步骤、新种分离与筛选的步骤第12页，共60页，编辑于2022年，星期六（一）含微生物样品的采集（一）
10、含微生物样品的采集如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大?采样时应注意的问题采样时应注意的问题采样时应注意的问题采样时应注意的问题:土壤微生物的分布土壤微生物的分布采土深度采土深度土壤植被情况土壤植被情况采样季节采样季节土壤的酸碱度土壤的酸碱度第13页，共60页，编辑于2022年，星期六对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛。土壤来源广泛。在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种。
11、找新菌种。第14页，共60页，编辑于2022年，星期六采样季节采样季节采样季节采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。：以温度适中，雨量不多的秋初为好。：以温度适中，雨量不多的秋初为好。：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采采采采土土土土方方方方式式式式：在在在在选选选选好好好好适适适适当当当当地地地地点点点点后后后后，用用用用小小小小铲铲铲铲子子子子除除除除去去去去表表表表土土土土，取取离离地地面面5-15cm处处的的土土约约10g，盛盛盛盛入入入入清清清清洁洁洁洁的的的的牛牛牛牛皮皮皮皮纸纸纸纸袋袋袋袋或或或或塑塑塑塑料料料料袋袋袋袋中中中中，扎扎扎扎好好好好，标标标标记记记记，记记记记录
12、录录录采采采采样样样样时时时时间间间间、地地地地点点点点、环环环环境境境境条条条条件件件件等等等等，以备查考。以备查考。以备查考。以备查考。为为为为了了了了使使使使土土土土样样样样中中中中微微微微生生生生物物物物的的的的数数数数量量量量和和和和类类类类型型型型尽尽尽尽少少少少变变变变化化化化，宜宜宜宜将将将将样样样样品品品品逐步分批寄回，以便及时分离。逐步分批寄回，以便及时分离。逐步分批寄回，以便及时分离。逐步分批寄回，以便及时分离。第15页，共60页，编辑于2022年，星期六（二）富集培养（二）富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要
13、分离的菌种数量不多时，就要若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为称为富集培养富集培养。方法：方法：控制一定的养分，例如碳源的控制。控制一定的养分，例如碳源的控制。控制一定的培养条件。控制一定的培养条件。第16页，共60页，编辑于2022年，星期六（三）纯种分离（三）纯种分离划线分离法划线分离法稀释分离法稀释分离法组织分离法组织分离法第17页，共60页，编辑于2022年，星期六 在营养平板上贴好标签，在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名名、菌种学名以及培养基名称
14、。称。步骤十步骤十第18页，共60页，编辑于2022年，星期六第19页，共60页，编辑于2022年，星期六（四）生产能力的考察（四）生产能力的考察1、初筛、初筛以量为主以量为主初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。的产物的菌种筛选出来的过程。2、复筛、复筛以质为主以质为主平板筛选平板筛选摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选第20页，共60页，编辑于2022年，星期六（五）微生物选择分离的原理和方法（五）微生物选择分离的原理和方法1、变色圈法、变色圈法2、透明圈法、透明圈法3、生长圈法、生长圈法4、抑菌圈法、抑菌圈法第21页，共60页，编辑于20
15、22年，星期六1、变色圈法在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分解底物或代谢产引起平板上出现变色圈，使所需微生物解底物或代谢产引起平板上出现变色圈，使所需微生物解底物或代谢产引起平板上出现变色圈，使所需微生物解底物或代谢产引起平板上出现变色圈，使所需微生物能够被快速鉴别出来。能够被快速鉴别出来。能够被快速鉴别出来。能够被快速鉴别出来。例如，筛选果胶酶产生菌时，用含例如，筛选果胶酶产生菌时，用含例如，筛选果胶酶产生菌时，用含例如，筛选果胶酶产生
16、菌时，用含0 0 0 02 2 2 2果胶为唯一碳源，待培果胶为唯一碳源，待培果胶为唯一碳源，待培果胶为唯一碳源，待培养基平板菌落长成后加入养基平板菌落长成后加入养基平板菌落长成后加入养基平板菌落长成后加入0 0 0 02 2 2 2刚果红溶液染色刚果红溶液染色刚果红溶液染色刚果红溶液染色4 h4 h4 h4 h，具有分解果，具有分解果，具有分解果，具有分解果胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。第22页，共60页，编辑于2022年，星期六3、生长圈法工具菌是一些营养缺陷型菌株。工具菌是一
17、些营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少工将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上，进行培具菌所需营养物的平板培养基上，进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养，在养，若某菌株能合成工具菌所需营养，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。长圈。第23页，共60页，编辑于2022年，星期六细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，加
18、麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，2525培养培养培养培养24-48h24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-32-3代代代代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培
19、养基为含麦芽汁、CaCOCaCO3 3的琼脂培养基的琼脂培养基的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）R Rf f值定性值定性值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点）乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）第24页，共60页，编辑于2022年，星期六放线
20、菌的分离：放线菌的分离：放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例以产链霉素菌种的分离为例以产链霉素菌种的分离为例以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）（从退化菌种中筛选）（从退化菌种中筛选）（从退化菌种中筛选）取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品1 1 1 1环环环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml 10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落采
21、用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据筛选模型：形态依据第25页，共60页，编辑于2022年，星期六真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以取发酵液少许以取发酵液少许以1010倍稀释成倍稀释成倍稀释成倍稀释成1
22、010-1-1-10-10-7-7 稀释分离法稀释分离法稀释分离法稀释分离法 取取取取0.1ml 0.1ml 加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（22）在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，2525培养培养培养培养48-72h48-72h 形态筛选形态筛选形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至
23、少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生生生生成成成成子子子子囊囊囊囊孢孢孢孢子子子子速速速速度度度度测测测测定定定定 发酵力测定发酵力测定发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定双乙酰含量测定双乙酰含量测定第26页，共60页，编辑于2022年，星期六用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选选，称为诱变育种称为诱变育种.诱变剂：能够提高生物体突变频
24、率的物质称为诱变剂。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。诱变剂诱变剂物理：紫外，快中子物理：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍二、诱变育种二、诱变育种第27页，共60页，编辑于2022年，星期六（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题n出发菌株的选择出发菌株的选择n诱变剂的选择诱变剂的选择n诱变剂量的选择诱变剂量的选择n单孢子（细胞）悬液的制备单孢子（细胞）悬液的制备第28页，共60页，编辑于2022年，星期六出发菌株选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生选好
25、出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面用作诱变的出发菌株必
26、须对它的产量、形态、生理等方面用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面有相当了解。有相当了解。有相当了解。有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及筛选条件。筛选条件。第29页，共60页，编辑于2022年，星期六出发菌株的选择出发菌株的选择1 1 1 1自自自自然然然然界界界界新新新新分分分分离离离离的的的的野野野野生生生生型型型型菌菌菌菌株株株株，对对对对诱诱诱诱变变变变处处处处理理理理较较较较敏敏敏敏感感感感，容容容容易易易易达达达达到好的效果。到好的
27、效果。到好的效果。到好的效果。2 2 2 2在在在在生生生生产产产产中中中中经经经经生生生生产产产产选选选选种种种种得得得得到到到到与与与与野野野野生生生生型型型型较较较较相相相相像像像像的的的的菌菌菌菌株株株株，也也也也是是是是良良良良好好好好的的的的出出出出发菌株。发菌株。发菌株。发菌株。3 3 3 3每每每每次次次次诱诱诱诱变变变变处处处处理理理理都都都都有有有有一一一一定定定定提提提提高高高高的的的的菌菌菌菌株株株株，往往往往往往往往多多多多次次次次诱诱诱诱变变变变能能能能积积积积累累累累较多的提高。较多的提高。较多的提高。较多的提高。4 4 4 4出发菌株开始时可以同时选出发菌株开始
28、时可以同时选出发菌株开始时可以同时选出发菌株开始时可以同时选2 2 2 23 3 3 3株。株。株。株。5 5 5 5要要要要尽尽尽尽量量量量选选选选择择择择单单单单倍倍倍倍体体体体细细细细胞胞胞胞、单单单单核核核核或或或或核核核核少少少少的的的的多多多多细细细细胞胞胞胞体体体体来来来来作作作作出出出出发发发发诱诱诱诱变变变变细细细细胞。胞。胞。胞。第30页，共60页，编辑于2022年，星期六诱变剂的选择诱变剂的选择根据经验或菌种的已有诱变背景选择诱变剂。根据经验或菌种的已有诱变背景选择诱变剂。同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效
29、果下降。同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。作用于休止期，就可选用孢子。作用于休止期，就可选用孢子。作用于休止期，就可选用孢子。第31页，共60页，编辑于2022年，星期六几种物理、化学诱变剂的使用方法几种物理、化学诱变剂的使用方法A 紫外线紫外线 紫外线是一种使用时间较久，廉价，危危险险性
30、性小小，诱诱变变效效果果好好，故应用最广泛，研究得也最多。对诱变最有效的波波长长是是260 260 nmnm左左右右（253253265265）nmnm。一一般般诱诱变变时时用用菌菌（孢孢子子）悬悬浮浮液液进进行行处处理理，紫紫外外灯灯的的功功率率为为15W15W，距距离离固固定定在在30 30 cmcm左右。左右。紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。第32页，共60页，编辑于2022年，星期六B B 快中子快中子中中子子是是原原子子核核的的组组成成部部分分、是是不不带带电电荷荷的的粒粒子子，可可由由回回旋旋加加速速器器、静静电加速器
31、或原子反应堆产生。电加速器或原子反应堆产生。中中子子不不直直接接产产生生电电离离，但但能能使使吸吸收收中中子子的的物物质质的的原原子子核核射射出出质质子子来来，因因而而快快中中子子的的生生物物学学效效应应，几几乎乎完完全全是是由由质质子子造造成成的的。受受中中子子照照射射的的物物质质所所射射出出的的质质子子是是不不定定向向的的，照照射射后后产产生生的的电电离离，则则集集中中在在受受照照射射物体内沿着质子的轨迹上。物体内沿着质子的轨迹上。中中子子分分为为快快中中子子和和慢慢中中子子。快快中中子子的的能能量量为为0.20.21010百百万万电电子子伏伏特特，慢慢中中子子的的能能量量为为l l404
32、0100100电电子子伏伏特特。慢慢中中子子的的效效应应同同射射线线、射射线线和和电电子子等等照照射射时时引引起起的的基基本本相相同同，快快中中子子较较X X射射线线、射射线线具具有较大的电离密度因而能更多地引起有较大的电离密度因而能更多地引起点突变点突变和和染色体畸变染色体畸变。第33页，共60页，编辑于2022年，星期六剂剂量量范范围围约约为为100-1500戈戈。快快中中子子在在诱诱变变育育种种中中有有较较好好的的效效果果，近近年年来来国国内内已已广广泛泛应应用用。由由于于剂剂量量测测量量还还不不统统一一，不不同同反反应应堆堆或或其其他他中中子子源源所所放放射射的的快快中中子子能能量量亦
33、亦不不同同。因因此此，诱诱变变结结果果也也很很不不一一致致，为为此此，国国际际原原子子能能组组织已提倡推广标准化的照射装置。织已提倡推广标准化的照射装置。第34页，共60页，编辑于2022年，星期六氮氮 芥芥氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。般使用的是其盐酸盐。般使用的是其盐酸盐。般使用的是其盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变
34、异。氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。得最早的一种诱变剂。第35页，共60页，编辑于2022年，星期六亚硝酸亚硝酸常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。碱基中的氨基。亚硝酸亚硝酸A H（次黄嘌呤）（次黄嘌呤）C UG X（黄嘌呤）（黄嘌呤）n亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出出NONO和和NONO2 2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在。所以，可在临用前将亚硝酸
35、钠放在pH4.5pH4.5的醋酸缓冲的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。液中，使先生成亚硝酸然后再使用。第36页，共60页，编辑于2022年，星期六亚硝基胍亚硝基胍(NTG)是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到汰便可直接得到汰便可直接得到汰便可直接得到12%12%12%12%至至至至80%80%80%80%的营养缺陷型菌株，有超级诱变的营养缺陷型菌株，有超级诱变的营养缺陷型菌株，有超级诱变的营养缺陷型菌株，有超级
36、诱变剂之称。剂之称。剂之称。剂之称。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。通常在浓度为通常在浓度为通常在浓度为通常在浓度为30ug/ml30ug/ml30ug/ml30ug/ml、温度为、温度为、温度为、温度为28C28C28C28C和时间为和时间为和时间为和时间为60min60min60min60min的条的条的条
37、的条件下进行处理，容易得到高产菌株件下进行处理，容易得到高产菌株件下进行处理，容易得到高产菌株件下进行处理，容易得到高产菌株 。第37页，共60页，编辑于2022年，星期六剂量选择剂量选择 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率
38、下降。目前一般用目前一般用目前一般用目前一般用死亡率为死亡率为死亡率为死亡率为70%-80%70%-80%时的剂量。时的剂量。时的剂量。时的剂量。剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量
39、可能引起遗传物质的巨大损伤，产生变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。回复突变少，促使变异后菌株的稳定。回复突变少，促使变异后菌株的稳定。回复突变少，促使变异后菌株的稳定。凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。适剂量。适剂量。适剂量。第38
40、页，共60页，编辑于2022年，星期六处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液。状态的、活力类似的菌悬液。1 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2 2）可避免长出不纯的菌落。）可避免长出不纯的菌落。）可避免长出不纯的菌落。）可避免长出不纯的菌落。第39页，共60页，编辑于2022年，星期六处理前，细胞应尽可能达到处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态同步生长状态。细胞菌龄一般在对数期。细胞菌龄一般在对数期。霉
41、菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。理一般应采用孢子悬浮液。菌菌悬悬液液浓浓度度：真真菌菌106 107个个/mL，细细菌菌放放线菌线菌108个个/mL。第40页，共60页，编辑于2022年，星期六（四）中间培养（四）中间培养 由由由由于于于于在在在在发发发发生生生生了了了了突突突突变变变变尚尚尚尚未未未未表表表表现现现现出出出出来来来来之之之之前前前前，有有有有一一一一个个个个表表表表现现现现延延延延迟迟迟迟的的的的过过过过程程程程，即即即即细细细细胞胞胞胞内内内内原原原原有有有有酶酶酶酶量量量量的的的的稀稀稀稀释释释释过过过过程
42、程程程(生生生生理理理理延延延延迟迟迟迟)，需需需需3 3 3 3代代代代以以以以上上上上的繁殖才能将突变性状表现出来。的繁殖才能将突变性状表现出来。的繁殖才能将突变性状表现出来。的繁殖才能将突变性状表现出来。中间培养对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。中间培养对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。中间培养对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。中间培养对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。第41页，共60页，编辑于2022年，星期六方法：方法：让让变变异异处处理理后后细细胞胞在在液液体体培培养养基基中中培培养养几几小小时时，以以让让细细胞胞的的遗遗传传物物质质复复制制，让细胞
43、繁殖几代，以得到纯的变异细胞。让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。第42页，共60页，编辑于2022年，星期六（五）分离和筛选（五）分离和筛选 筛筛筛筛选选选选分分分分初初初初筛筛筛筛和和和和复复复复筛筛筛筛。初初初初筛筛筛筛以以以以迅迅迅迅速速速速筛筛筛筛出出出出大大大大量量量量的的的的达达达达到到到到初初初初步步步步要要要要求求求求的的的的分分分分离离离离菌菌菌菌落落落落为为为为目的，以量为主。目的，以量为主。目的，以量为主。目的，以量为主。复复复复筛筛筛筛则则则则是是是是精精精精选选选选，以以以以质质质质为为为为主主主主，也也也也就就就就是是是是以以以以精精精精确确确确度度度度为为为为主
44、主主主。因因因因此此此此在在在在具具具具体体体体方方方方法法法法上上上上就就就就有差异有差异有差异有差异.例例例例如如如如初初初初筛筛筛筛可可可可以以以以在在在在平平平平皿皿皿皿上上上上直直直直接接接接以以以以菌菌菌菌落落落落的的的的代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物与与与与某某某某些些些些染染染染料料料料或或或或基基基基质质质质的的的的作作作作用用用用形形形形成成成成的的的的变变变变色色色色圈圈圈圈或或或或透透透透明明明明圈圈圈圈的的的的大大大大小小小小来来来来挑挑挑挑取取取取参参参参加加加加复复复复筛筛筛筛者者者者，而而而而将将将将90%90%90%90%的的的的菌菌菌菌落落落落淘淘淘淘汰汰
45、汰汰。在在在在数数数数量量量量减减减减少少少少后后后后就就就就要要要要仔仔仔仔细细细细比比比比较较较较参参参参加加加加复复复复筛筛筛筛和和和和再再再再复复复复筛筛筛筛的的的的菌菌菌菌株株株株，最最最最后后后后才才才才能能能能选选选选得得得得优优优优秀秀秀秀菌菌菌菌株株株株。在在在在以以以以后后后后的的的的复复复复筛筛筛筛阶阶阶阶段段段段，还还还还应应应应不不不不断断断断结结结结合合合合自然分离，纯化菌株。自然分离，纯化菌株。自然分离，纯化菌株。自然分离，纯化菌株。第43页，共60页，编辑于2022年，星期六 第第 一一 轮：轮：1个出发菌株个出发菌株诱变处理诱变处理200个单细胞菌株个单细胞菌
46、株50 株株5 株株初筛初筛每株每株1瓶瓶复筛复筛每株每株4瓶瓶 第第 二轮：二轮：5个出发菌株个出发菌株诱变处理诱变处理40株株40株株40株株40株株40株株50 株株5 株株初筛初筛每株每株1瓶瓶复筛复筛每株每株4瓶瓶第44页，共60页，编辑于2022年，星期六三、杂交育种三、杂交育种杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经结是指将两个基因型不同的菌株经结合（或接合）或原生质体融合使遗传物质合（或接合）或原生质体融合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。菌株。第45页，共60页，编辑于2022年，星期六杂交育种的目的杂交育种的目的（1
47、 1 1 1）通通通通过过过过杂杂杂杂交交交交使使使使不不不不同同同同菌菌菌菌株株株株的的的的遗遗遗遗传传传传物物物物质质质质进进进进行行行行交交交交换换换换和和和和重重重重新新新新组组组组合合合合，从从从从而而而而改改改改变变变变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；（2 2 2 2）可可可可以以以以通通通通过过过过杂杂杂杂交交交交把把把把不不不不同同同同菌菌菌菌株株株株的的的的优优优优良良良良生生生生产产产产性性性性能能能能集集集集中中中
48、中于于于于重重重重组组组组体体体体中中中中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3 3 3 3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；甚至出现新的品种；甚至出现新的品种；甚至出现新的品种；（4 4 4 4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促
49、进遗传）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。学理论的发展。学理论的发展。学理论的发展。第46页，共60页，编辑于2022年，星期六原生质体融合技术原生质体融合技术所谓所谓原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只
50、有原生质作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称膜包裹着的球状体（称膜包裹着的球状体（称膜包裹着的球状体（称原生质体原生质体原生质体原生质体）。）。）。）。两亲本的原生两亲本的原生两亲本的原生两亲本的原生质体在质体在质体在质体在高渗条件下高渗条件下高渗条件下高渗条件下使之混合，由使之混合，由使之混合，由使之混合，由聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）作为助）作为助）作为助）作为助融剂融剂融剂融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组，使