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1、12、影响产物提炼，使产物质量不得保证如溶媒存在，使培养液乳化，不易分层（1）有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开（2）离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量第1页/共99页23，对产品质量的影响（1）对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。（2）对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。第2页/共99页34，对过滤的影响发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。造成
2、过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。5，染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。发酵染菌的危害1，直接经济损失2，间接经济损失第3页/共99页4（二）、与危害程度相关的几个方面与产品的品种有关，酒精和丙酮丁酸较小 AA核酸严重 抗生素（窄谱 广谱）染菌与发酵周期有关，发酵周期长，较易染菌，如前中期染菌后果较严重。第4页/共99页5杂菌类型染球菌：后果较严重，其繁殖速度特快，染短杆菌：后果较严重，染菌的时间越早，危害越大，染菌量越多，危害越大。染菌原因：公共系统引起染菌，影响面大，后果严重，公
3、共系统为空气，总过滤器，空气管道不严密，公共补料系统，公共系统染菌，就会引起连续染菌，大面积染菌。第5页/共99页6（三）、发酵过程中染菌的检查判断 1，杂菌的检查方法 借助适当的方法，才能正确而及时地发现发酵过过程是否污染杂菌和染菌的原因与途径。检查杂菌的方法，要求淮确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果。目前生产上常用的检查方法有：显微镜检查；平板划线检查；肉汤培养检查。第6页/共99页7判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。无菌试验的目的：（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角第7页/共9
4、9页82，各种检查方法的比较3种方法各有优缺点，显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易捡出早期杂菌。平板划线法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能捡出更少的杂菌。第8页/共99页93，杂菌检查中的问题（1)，检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据（2），平板划线和肉汤培养应做三个平行样（3），要定期取样（4），酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去（5），取样时防止外界杂菌混入的措施第9页/共99页10第10页/共99页114，检查的工序和时间选择那些生产工序和时
5、间的样品检查也是十分重要的问题。科学合理的选择检查工序和时间，对于除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有着直接的指导意义。有时即使由于检查时间较长，未能及时指导本批生产，但对于找出造成染菌事故的环节，分析染菌原因，杜绝染菌漏洞也是不可缺少的。由于生产菌种及产品的不同，检查的时间也不完全一样：但总的原则是一致的，即每个工序或经一定时间都应进行取样检查。检查的一般时间或工序见下表。第11页/共99页12发酵过程的杂菌检查第12页/共99页13除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据pH值、尾气中CO2含量和溶解氧等参数的异常变化来判断是否染菌。第13页/共99页14（四）、发酵染菌率和染菌
6、原因的分析发酵染菌能给生成带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。发酵设备、空气除菌系统和培养基灭菌系统等的有关设备以及管道的配置都必须严格符合无菌要求。如果设备结构和管道配置不合理，制造、安装不注意或在发酵过程中操作不慎就会使发酵液污染杂菌，导致产量下降甚至得不到产品。在发酵前期或中期染菌，杂菌会很快消耗掉营养物质，使生产菌无法正常生长而引起倒罐。在发酵后期染菌，虽然没有早期或中期染菌的影响大，一般会使产率下降并影响产物的提取，但如核苷酸等某些产品的发酵即使在后期染菌，也会使发酵产物被所染杂菌迅速消耗掉而得
7、不到产品。第14页/共99页15因此，染菌问题是影响产率和后工序操作的主要因素之一，必须予以重视。认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。“决定的因素是人不是物”。只要我们思想上重视，对各个因素和环节周密考虑、严格掌握，是完全可以避免和减少污染的。本节将根据以往工厂中发生染菌事故的经验教训来分析发酵系统中染菌的原因，来认识整个发酵过程中可能造成污染的各种途径并提出相应的防治措施。由于发酵生产的连贯性强，在整个生产过程中各个环节的污染问题都不能忽视，所以本章除了着重讨论发酵设备方面的污染防止问题外，对于培养种子设备的要求和有关操作方法也作一般介绍。第15页/共99页161、发酵染菌率（1），总染
8、菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率。（2），设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。（3），不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。（4），不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。（5），季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。（6），操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。第16页/共99页172、染菌原因的分析避免在发酵生产中污染杂
9、菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。如果原因一经查出，解决的办法还是比较容易和迅速的。所以，我们必须善于透过现象看本质，对染菌的情况作具体分析，不致盲目寻找而耽误了时间，也不致于将染菌的真正原因遗漏而造成连续染菌事故。下面根据发酵工厂的生产经验，从一般染菌的现象来分析引起染菌的可能原因。第17页/共99
10、页18上述资料是国内外抗菌素生产中统计了多年生产中发生染菌现象的各种原因所占的百分比，今列出以供参考。从发酵工厂的生产经验来看，染菌原因是以设备渗漏和空气系统的染菌为主，其他则次之。第18页/共99页19（五）引起染菌的主要途径和原因 生产环节 1、种子培养阶段可能染菌生产菌种在保存、转移时可能染菌种子扩大培养，种子罐可能染菌，培养基可能带菌防止方法：选育抗污染能力强的菌株，定期进行分离，严格无菌操作，培养基首先要进行无菌试验，种子本身也要做无菌试验。第19页/共99页202、培养基灭菌不彻底，培养基要求灭菌彻底，培养基尽量不能破坏，灭菌过程中，培养基要达到预定体积，培养基灭菌后泡沫不可太多，
11、培养基灭菌方法连续消毒，优点:高温,短时,培养基破坏较小，实罐消毒（分批清毒）培养基装到罐中，蒸气通入罐中进行消毒，培养基灭菌的几个环节易造成染菌的：冷空气排除不彻底造成假压，蒸汽预热8090（三路进气 列管 排料管进空气管）蒸气走短路，由于空气走阻力小的管道第20页/共99页21负压抽吸：灭菌后，不可立即排冷却水，要通无菌空气保压，空气冷却后收缩，压力突然下降，把外面冷空气在严密度不够的缝隙进去。泡沫过多，当进气过份，使泡沫过多，其传热性差，使其中杂菌保留。3、空气系统：空气过滤系统出问题 主是要过滤介质失效。4、设备渗漏：设备安装不合理，有死角存在。再就是因为操作不当引起染菌第21页/共9
12、9页22（六）情况分析1、杂菌类型：染芽孢者：设备死角，使芽孢存活。染霉菌：培养基灭菌不彻底之故。染球菌：大部分从空气来，主要是空气过滤系统失效。染G-：大部分从水中来，是由于设备的渗漏。第22页/共99页23（六）情况分析1、杂菌类型：染芽孢者：设备死角，使芽孢存活。染霉菌：培养基灭菌不彻底之故。染球菌：大部分从空气来，主要是空气过滤系统失效。染G-：大部分从水中来，是由于设备的渗漏。第23页/共99页242、还可以从染菌的规模来分析：如车间中多罐同时染菌，且菌类型相同，则问题出在公共系统，如连消系统，空气总过滤器，共同的移种管道，加油管道，补料管道；如单罐连续染菌，个别发酵罐连续染菌大多是
13、由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。与此罐相联系的系统，包括分过滤器，与此罐相联的管道死角。第24页/共99页25如偶然染菌这种情况较复杂，几种情况都可能，偶尔单罐染菌，则为操作不慎引起。3、从染菌时间来分析：如发酵早期染菌，可能种子罐染菌，培养基灭菌不彻底，发酵中的早期染菌设备渗漏，管道有死角还可能操作不慎染菌防治，以防为主。综上所述，引起染菌的原因很多。“世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。”我们不能机械地认为某种染菌现
14、象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施。严格无菌操作，加强对染菌的监测，第25页/共99页26（七）、发酵染菌的防止【一】、种子带菌的原因及防止1，带菌的原因（1）无菌室的无菌条件不符合要求；（2）培养基灭菌不彻底；（3）操作不当。第26页/共99页272，种子带菌的防止种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。第27页/共99页28（1）无菌室接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。无菌室
15、面积不宜过大，一般约46米2高约2.6米。为了减少外界空气的侵入，无菌室要有13个套间(缓冲过道)(参照下图)。无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。第28页/共99页29无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。通常用30瓦紫外线灭菌灯照射2030分钟即可。紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀调效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。第29页/共99页30无菌室的立
16、视图第30页/共99页31配合使用的化学灭菌药剂有：用作喷洒或揩擦的(以揩擦为主)有75%酒精、0.25%新洁而灭(季胺盐)、0.61%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂(来苏尔)、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空间约用10毫升)或硫磺(每立方米空间约用23克)。要根据不同情况采用不同的灭菌剂。如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。第31页/共99页32无菌室内无菌度的要求是：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌
17、室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。无菌室的利用次数要恰当，每次使用时间也不宜过长。用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。第32页/共99页33（2）灭菌锅 灭菌锅是一种压力容器，作为培养种子及小型试验用具的灭菌之用，有立式和卧式两种。灭菌操作时需要注意排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞。如果排气管不道，锅内空气排不出去形成气团，蒸汽就不易渗入，从而使灭菌不彻底。用某种较耐热的芽抱杆菌进
18、行试验证明：在排气不通畅的情况下，以1公斤/厘米2的蒸汽压力经30分钟灭菌后进行检查，发现某些部位的三角瓶中，灭菌前放入的芽抱杆菌没有被杀死。如果不是采用蒸汽而是用锅内烧水的办法进行灭菌，那末排气的时间更要长一些，不然水蒸汽来不及驱出空气而使被灭菌的瓶中的冷空气排不尽。第33页/共99页34通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121C所需的时间与瓶内培养基的体积有关，其试验结果见下表。通入表压为1公斤厘米2的蒸汽时，三角瓶中培养基的体积与升温时间的关系实际上，使用蒸汽的压力一般大于1公斤/厘米2，所以上表的数据仅供对照参考，但根据上表的试验结果可以说明培养基体积与升温时间的关系。第34页/共99页3
19、5（3）摇瓶机 摇瓶机(亦称摇床)是培养好气菌的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇瓶机有往复式(图7-2)和旋转式(图7-4)两种。往复式摇瓶机的往复频率一般在80140次分，冲程一般为614厘米，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装料过多，在摇动时液体要溅到包瓶口的纱布上易引起染菌，特别是启动时更易发生这种情况。第35页/共99页36旋转式摇瓶机的偏心距一般在36厘米之间，旋转次数为60300转分。放在摇瓶机上培养瓶中发酵液所需的氧是由室内空气经瓶口包扎的纱布(一般是八层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小，瓶口的几何形状和棉塞或纱布层的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系
20、数(亚硫酸氧化值)Kd取决于摇瓶机的特性和三角瓶的装料量，见表7-2。第36页/共99页37往复式摇瓶机(图7-2)是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方形框子，有一层至三层托盘，托盘上开有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的震动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇瓶机的频率和偏心距的大小第37页/共99页38对氧的吸收有明显的影响。据有关文献报导，当冲程为10厘米、往复频率为200次/分，Kd值可达2.41毫克分子氧/升，分，大气压；当冲程为5厘米、往复频率240次/分时
21、，Kd值可达1.25毫克分子氧/升，分，大气压。第38页/共99页39第39页/共99页40第40页/共99页41第41页/共99页42 根据支承装置结构不同，往复式摇瓶机分为滚轮式和悬挂式两种。滚轮式摇瓶机是将摇床置于四个滚轮上，悬挂式摇瓶机(图7-3)是用四条吊杆将摇床吊在机架上，结构较为简单，托盘可装至三层以上，能放510升甚至更大的瓶，动力消耗较少。但悬挂式摇瓶机如为多层时，每层的冲程不一样，越是上层冲程越小。故使用多层悬挂式摇瓶机时应予注意。第42页/共99页43旋转式摇瓶机是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铜板、塑料板或木板制造。托盘由三根呈等边三角形分
22、布的偏心轴支承，也有用滚动轴承作支承的。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。此种摇瓶机结构比较复杂，加工安装要求比往复式高，造价也较贵。其优点是氧的传递较好，功率消耗小，培养基不会溅到瓶口的纱布上。第43页/共99页44有关文献报导，采用旋转式摇瓶机，对于300毫升或600毫升的三角瓶，当转数在500转/分和具有各种挡板条件下，与实装培养液10升具有六叶涡轮搅拌器的实验型发酵罐（通风率0.6米vvm；1000转/分)的Kd值一样。所以摇瓶机将成为放大发酵试验过程中的一种更有效的工具。第44页/共99页45【二】、发酵设备、管件的渗漏与配置设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀
23、、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。第45页/共99页46（）发酵罐的渗漏 1，冷却管的渗漏 由于发酵液具有一定的酸度和含有某些腐蚀性强的物质(如亚硫酸盐、硫酸铵等)冷却钢管很易受到腐蚀。发酵液中含有固体物料时，固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损。管内冷却介质一般为井水或自来水，因水的化学成分和流动时的冲击以及加热时蒸汽冲击的影响，管内壁也会引起腐蚀及磨损。所以冷却管是发酵罐中最容易渗漏的部件之一。而最易穿孔的部分是冷却列管的弯曲处，原因是弯曲处外壁减薄和加热煨弯时使
24、材料的性质有所改变所致。冷却水的压力通常大于罐压，如果有微孔，冷却水就会进入发酵液而引起染菌。第46页/共99页47检查列管有否渗漏，在漏孔极其微小时是不易发现的。需要将管外壁的污垢铲除后，将管子烘干，管内加水压，才能发现渗漏的部位。管子与罐体的连接方式有两种：法兰联接和焊接。法兰虽然易于拆卸更换，但联接处有垫片易渗漏，而焊接则无此种现象。为了及早发现漏孔予以排除，冷却管要定期检查作渗漏试验。第47页/共99页48 试漏方法有两种：气压试验和水压试验。水压试验是用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管，泵到一定压力时，观察管子有否渗漏现象。气压法是先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水
25、面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便，但管子下部弯曲处积水不易排尽，有漏孔时不产生气泡就难以发现。采用不锈钢制造的冷却管，耐腐蚀情况比普通钢管要好得多，产生漏孔的机会也比普通钢管少。但如加工时不符合不锈钢材料加工的技术要求(如热处理，焊条牌号的选择及焊接工艺等)，就会改变不锈钢材的结晶组织，发生危害较严重的晶间腐蚀现象。第48页/共99页49 2，罐体的穿孔 浸没在液体中的罐体部分都有可能发生腐蚀穿孔，特别是罐底，由于管口向下的空气管喷出的压缩空气的冲击力以及发酵液中的固体物料在被搅动时对罐底发生摩擦，罐底极易磨损引起渗漏，这种磨损形式是钢板产生麻点般的斑痕，称为麻蚀。
26、每年大修时需检查钢板减簿的程度。有夹套的发酵罐可在夹套内用水压或气压的试验方法检查罐壁有无渗漏。有保温层的发酵罐，如果水经常渗入保温层并积聚在里面，罐外壁就产生不均匀的腐蚀现象，所以当保温层有裂缝和损坏时，应及时修补。第49页/共99页50（）管件的渗漏 与发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样，而有其特殊的要求。第50页/共99页51 1，阀 据统计，因阀的渗漏引起的染菌占染菌率的比例很大，值得引起重视。与发酵罐直
27、接连通的管道更应选用密封性较高的阀门。目前使用的大小阀门大多采用截止阀和橡胶隔膜阀。第51页/共99页52（1）截止阀(图7-6)阀体为横放的S形，阀座与阀心的接触面小，污物不易附在上面，但构造比较复杂，流体阻力较大。由于截止阀能很方便地调节流量，小型发酵罐上大多采用这种阀门。平面形紧密面的垫料采用橡胶或聚四氟乙烯，关闭后垫料与阀座紧紧地吻合，达到不漏的目的。阀心垫料需定期检查，损坏后立即调换。截止阀在使用中经常发生以下两个问题：第52页/共99页53阀心轧坏。物料中的硬质物或焊接施工后的焊渣以及螺钉零件等被带到阀内，当关闭时，阀心与阀座被上述坚硬物轧住，能将紧密面轧成凹凸不平的痕迹，就关不严
28、密。填料的渗漏。操作时用扳手过分关紧，会使阀杆弯曲，弯曲后的阀杆不仅启动费力，并且使填料部分不紧密而引起渗漏，操作中需要注意。阀门在使用一定时间后，阀杆磨损或填料损坏也会引起渗漏，就需要将填料压盖适当拧紧或更换填料。第53页/共99页54第54页/共99页55（2）隔膜阀 隔膜阀的结构见图7-6。阀体内装有橡皮隔膜，用螺钉与阀芯连接，当阀杆作上下运动时就带动隔膜上升或下降。隔膜阀的制造要求不高，关键在于膜的性能，如采用橡皮隔膜阀，在一般情况下，对橡胶隔膜的要求是耐压4公斤/厘米2以上，耐温160以上，在压紧和放松时不变形。隔膜阀有以下优点：1)严密不漏。2)无填料。3)阀结构为流线型，流量大，
29、阻力小，无死角，无堆积物，在关闭时不会使紧密面轧坏。4)检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱落。第55页/共99页56第56页/共99页57 2，管路的连接 管子的连接有螺纹连接、法兰连接和焊接三种。(1)螺纹连接螺纹连接需在管端铰出管螺纹，安装时在螺纹上涂以白漆并加麻丝(也有用聚四氟乙烯薄膜)作为填料，如密封要求高的可用石墨粉加少许机油作为填料，或用氧化铅甘油胶合剂更好。螺纹连接简单，但装拆较麻烦，为了便于装拆，要在管路上适当位置安装活接头(亦称“由宁”)，接头平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈。由于管路受冷热和震动的影响，活接头的接口易松动，使密封面不能严密而造成渗漏。如在接种输液时，因液体
30、快速流动造成局部真空，在渗漏处将外界空气吸入、空气中的菌就被带入发酵罐中而造成危害。所以，重要的管路连接大多采用法兰连接。第57页/共99页58（2）法兰连接法兰连接密封可靠，压力、温度和管径的适用范围大，但费用较高。（3）焊接焊接的方法比其他方法简便，而且密封可靠。所以空气灭菌系统、培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好。但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接。管路、管件的试漏一般在管路中通入压缩空气并在焊缝和连接处涂以肥皂水，如有肥皂泡发生，则表示此处有泄漏，需重新焊接或安装。第58页/共99页59（）管路的配置 1，排气管与下水管第59页/共99页60发酵厂中若干发酵罐的排气管路大多汇集
31、在一条总的管路上，以节约管材，下水管亦然。但在使用中有相互串通，相互干扰的弊病，一只罐染菌往往会影响其他罐。排气管路的串通连接尤其不利于污染的防止。故对于排气和下水管路要考虑发酵的特点进行配置，对于容易染菌的场合还是以每台发酵罐具有独立的排气、下水管路为宜。倘若使用一根总的排气管时，必须选择较大直径的管子，保证排气下水通畅不致倒回到发酵罐内。第60页/共99页61 2，发酵罐的管路图7-7表示发酵罐(带空气分过滤器)的水、蒸汽和物料管路的配置。如有自控和测量仪表，那末还应包括这些仪表所需的有关管路(图中末包括)。由于罐体和有关管路均需用蒸汽进行灭菌，所以要保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的地区，对
32、于某些蒸汽可能达不到的死角(如阀)要装设与大气相通的旁路(图中的小阀门)。在灭菌操作时，将旁路阀门打开，使蒸汽自由通过。接种、取样和加油等管路要配置单独的灭菌系统，使能在发酵罐灭菌后或在发酵过程中单独进行灭菌。第61页/共99页62（四）发酵罐与管件的死角所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。现将经常出现死角的场合及形成死角的几种原因介绍如下：1，法兰连接的死角如果对染菌的概念了解不够，按照一般化工厂管路的常规加工方法来焊接和安装管道法兰就会造成死角。发酵工厂的有关管路要保持
33、光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。例如法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角(图7-8c)。垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角(图7-8a、b)。第62页/共99页63第63页/共99页642，渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角 培养基中如果含有钙盐类及固形物，在发酵罐的搅拌功率较小和采用环式空气分布管的情况下，由于在灭菌时培养基得不到强有力的翻动，罐底会形成一层12毫米甚至更厚的膜层(图7-9)。这种膜层具有一定程度的绝热作用，所以膜层下潜伏的耐热菌不易被杀死。对这种情况的发酵罐必须定期铲除罐底积垢。大的发酵罐
34、，为了减少搅拌轴的摆动，罐底装有底轴承，轴承支架处也容易堆积菌体。如果在底轴承下增设一个小型搅拌桨就可以适当改善罐底积垢的情况(图7-10)。环式空气分布器在整个环管中空气的速度并不一致，靠近空气进口处流速最大，远离进口处的流速减小，当发酵液进入环管内，菌体和固形物就会逐渐堆积在远离进口处的部分形成死角，严重时甚至会堵塞喷孔(图7-11)。第64页/共99页65第65页/共99页66 发酵罐中除了上述容易造成死角的地区外，其他还有一些容易造成死角的地区，如挡板(或冷却列管)与罐身固定的支撑板周围和不能在灭菌时排气的百肠管，温度计接头等，对于这些地区每次放罐后的清洗工作应注意，经常检查。仔细清洗
35、才能避免因死角而产生的污染事故。第66页/共99页67第67页/共99页683，不锈钢衬里的死角 某些有机酸的发酵对碳素钢有腐蚀时，小型发酵罐通常采用不锈钢制造。对于大型发酵罐，为了节约不锈钢材料起见，一般都采用不锈钢衬里的方法，即在碳钢制造的壳体内加衬一层薄的不锈钢板(厚约13毫米)。如果不锈钢衬里加工焊接不善，在钢板和焊缝处有裂缝，或在操作时不注意，使不锈钢皮鼓起后产生裂缝，发酵液就会通过裂缝进入衬里和钢板之间，窝藏在里面形成死角(图712)。不锈钢皮怎样会鼓起的呢？因为作为衬里的不锈钢皮较薄，在培养液分批灭菌或空罐灭菌时，发酵罐经加热后再行冷却，如果此时不及时通入无菌空气保持一定压力，那
36、末会因蒸汽的突然冷凝体积减小而形成真空将衬里吸出，严重者造成破裂。第68页/共99页69所以对于不锈钢衬里设备加工时应该尽可能增加衬里的刚度，其办法是每隔一定距离用点焊增加衬里与钢制壳体的连接强度，减少鼓起的可能性。操作时要注意避免罐内发生真空现象。发生这种事故后，如衬里钢板尚未破裂可用罐内加水压的方法将其恢复原状(水的压力不应超过设备的允许使用压力)，应尽可能避免锤击，用锤击的方法使钢板受力不匀易造成破损。衬里与外壳之间的夹层中可用水压或气压方法检查其是否渗漏。采用复合钢板(将两种不同材质的钢板轧合为一体的钢板)制造发酵罐，因为两层钢板紧密结合在一起，中间没有空隙，所以不会产生上述问题，是一
37、种理想的材料。第69页/共99页70第70页/共99页714，接种管路的死角 接种一般采用以下两种方法：(1)压差接种法。存种子的血清瓶上装有橡皮管，在火封下与罐的接种口相连接，利用两者的压力差使种子进入罐内，要求瓶与橡皮管的连接不漏，橡皮管与接种口的大小一致。(2)微孔接种法。利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种，在操作时要注意防止注射器针孔堵塞。第71页/共99页72第72页/共99页73采用种子罐时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。如图7-13a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀2的半截上
38、装设旁通，焊上一个小的放气阀，如图7-13b所示，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。第73页/共99页74 5，排气管的死角 罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。另外排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。有的单位曾作过试验，将排气管做成每节可拆卸的，灭菌后将各节拆下分别检查就发现某些末被杀死的耐热菌。所以排气管要与罐的尺寸有一定比例，不宜过大或过小。第74页/共99页756，不合理补料管配置造成的死角不合理的补料管配置 合理的补料管配置第75页/共99页767，压力表安装不合理形成
39、的死角A：不合理；B：合理第76页/共99页77（）、空气过滤器 工业用的空气除菌系统中的空气过滤器一般都比较庞大，如果其中的纤维铺设不匀，密的部分阻力大，松的部分阻力小，就会使较多的空气沿着阻力小的部分流出，从而形成短路。走短路的那部分空气没有经过充分过滤而带菌，进入发酵罐将使发酵染菌。纤维层装得太松对过滤不利，太紧同样也会影响过滤效率。同时，在过滤介质用蒸汽灭菌时，太紧则蒸汽穿透力差，穿透力差灭菌效果也差。所以用过分压实纤维层的办法试图达到增加过滤效率的目的，实际上是适得其反。对于棉花过滤器最合适的充填密度是160180公斤米3；玻璃纤维是130180公斤米3左右。在铺纤维时分层均匀铺设是
40、必要的。第77页/共99页78、灭菌操作中的有关问题1，蒸汽和灭菌操作罐压1公升/厘米2，料温120并维持一定时间是一般实罐灭菌(即培养基的分批灭菌)的操作规范。根据操作经验，能否达到彻底灭菌的目的在于罐内压力能否控制得与应该达到的温度相对应，例如罐压已达到1公斤/厘米2而料温却并未达到120，则某些耐热的细菌芽孢就难以完全杀死。产生罐压和料温不相对应的情况是由于操作不合理所致，例如在灭菌开始时没有将罐内冷空气排除干净，蒸汽中掺入了冷空气使蒸汽的分压降低，蒸汽压力实际上没有达到1公斤/厘米2因而料温也就达不到120。第78页/共99页79为了加快加热时间，凡能进蒸汽的管路在灭菌时都可同时进汽，
41、但各管路的阻力不同，大量蒸汽从阻力小的进汽管中冲入罐内，这是一种蒸汽短路现象，使物料受热不匀，部分培养液过热而部分培养液则可能灭菌不透，尤其是罐底的空气分布管是主要的进汽口，但由于液柱压力较大，阻力就比其他进口大，所以在灭菌操作时应将空气分布管的进口阀门开得比其他进气口的阀门大一些，以保证有足够的蒸汽从空气分布管进入，促使培养液激烈翻动起搅拌混和作用。第79页/共99页80 灭菌蒸汽要求采用饱和蒸汽，冷凝水越少越好，冷凝水多，热量的穿透力就差，在冷凝水较多或蒸汽管道较长的情况下，蒸汽进车间后的总管上要装设汽水分离装置将冷凝水分离后再使用。总之，灭菌时蒸汽压力要求平稳，在压力变动较大时，操作人员
42、需灵活掌握加以控制。第80页/共99页812，泡沫问题 培养基中含有较多量的黄豆饼粉、花生粉或蛋白胨等成分时，在灭菌时这种培养基就容易产生泡沫，发生泡沫的温度约为90左右。泡沫严重时会上升到罐顶甚至逃液，此时操作就比较困难。实践证明：灭菌时泡沫严重的，就不易灭透。所以在发生泡沫时应加以清除(加消泡剂和在操作上予以控制)。发生泡沫的培养基灭菌不透的原因可能是由于某些耐热细菌潜伏在泡沫里，泡沫中的空气和泡沫的薄膜有隔热作用，热量不易穿透进去杀死其中潜伏的菌，一旦泡沫破裂，这些菌就被释出造成污染。第81页/共99页823，其他操作问题实罐灭菌时，当经过加热和维持时间后开始冷却，此时可能因蒸汽冷凝而使
43、罐压突然降低甚至会形成真空，所以此时必须将无菌空气通入罐内保持一定压力，并注意压力变化，随时进行调节。对于中小型发酵罐，一般经空罐灭菌(1.5公斤/厘米2，15分钟)后再将培养基放入罐内进行实罐灭菌。有些工厂为了节约蒸汽，直接进行实罐灭菌而不进行空罐灭菌，他们只有在检修后或在节日停工后以及春夏季节发酵罐空置了24小时以上时才进行空罐灭菌。这种方法如果操作上注意是完全可行的，也是一种节约燃料的有效措施。第82页/共99页83 大型发酵罐大多采用连续灭菌，这时空罐需先行灭菌。但也有在发酵完毕后，将空罐保压不灭菌就进连消好的培养基，这要根据各厂的生产菌株特性和生产设备等具体情况而定。对于发酵周期短的
44、菌株、突变影响小的发酵，采用保压不进行空罐灭菌的办法是可行的，但经一定发酵批数后仍需定期进行空罐灭菌，否则较难避免杂茵污染与遗传突变的影响。第83页/共99页84（八）、染菌后的挽救措施 为了减少损失，对被污染的发酵液要根据具体情况采取不同的挽救措施。已染菌要尽可能挽救，挽救的几种方法：第84页/共99页85种子罐染菌：先灭菌再倒罐，再空消取用备种或倒种。发酵罐染菌，根据染菌时间不同采取相应的方法。前期染菌：如染的菌危害不大，采取补种的方法，使生产菌在发酵罐中占绝对优势，如染的菌危害性较大，一般采用先补加营养再重新灭菌的方法，再接种。如染的菌危害极大，一般先放掉一部分发酵液，新配一部分培养基加
45、入，灭菌再接种，再发酵。第85页/共99页86中后期染菌：用降低罐温，调pH改变通气量的方法 目的在于降低杂菌繁殖速度对分法：在生产抗生素的生产中常用，降低杂菌数量，杂菌毒物浓度。靠加抑菌剂、杀菌剂，如抗生素，添加量根据实验来定。提前放罐进行提炼，在杂菌分泌的代谢物会分解产物，杂菌会分解产物情况下用，可加磷、玉米浆，让菌加速代谢，提前放罐。第86页/共99页87二、噬菌体的污染的防治1、噬菌体污染的后果比杂菌要严重得多，因为噬菌体的污染在发酵工作中极其普遍。其个体极小（0.1u）空气（菌0.50.813um）过滤介质都易受噬菌体污染，甚至厌气性发酵也会受噬菌体侵染。其繁殖快，会引起生产菌的大量
46、的快速的裂解，感染后的子代噬菌体可能是几十个甚至几百个。会产生发酵侵染噬菌体的恶性循环，可能引起整个车间连续倒罐。一般来说，新建的工厂（12年）不会有噬菌体污染，几年后才会染菌。染噬菌体与染杂菌正好相反，因为新建的工厂设备不严密，操作不熟练，而工厂周围这种噬菌体还不多。第87页/共99页88污染噬菌体的途径污染噬菌体的途径溶原菌为生产菌，其感染的的温和噬菌体，在转移中，由于条件的改变，可能发生变异，可能变为裂解性或烈性噬菌体，从而引起危害。噬菌体要感染的三个基本条件：环境中有噬菌体、环境中的有活菌体，要有接触条件。工厂周围一般都有噬菌体，通过气流，尘埃，人车来往，因而可能从生产的各个环节中侵染
47、。环境中活菌体随排气，从泡沫中排出，倒罐中，取样口，洗罐液中。根据途径，防治方法也应相应综合处理。第88页/共99页893、预防方法消灭噬菌体，首先要及时检查出噬菌体，要对周围环境进行普查，对工厂的排气，各种废液，地面取样，设备管道表面进行检查。常用琼脂平板法，以生产菌为指示菌，观察是否有噬菌斑，噬菌斑的多少。当有噬菌体威胁时，要经常检查种子液，发酵液是否正常，有无异常现象，有些异象与染杂菌一样，泡沫增多，pH异常，发醇产物减少，还有不同于染菌杂菌的异象，OD值锐减，C、N利用下降甚至不利用，倒罐前要灭菌，洗罐取样要集中在一个地方，废气要通过药物处理。第89页/共99页90要定期对生产环境采取
48、药物处理。大面积（为地面），要漂白粉，石灰水喷洒。小面积（为培养室等）用新洁尔灭。改进生产设备：空压机的进风口要安在离开地面比较高的空中（25m以上），高空中噬菌体较少。第90页/共99页91选育抗噬菌体的菌株如红霉素，链霉素，卡那霉素，肌甘，丙酮丁醇的菌体都有不同抗噬菌体性但这种菌株地方性强，因为类型、物性不同。这种抗性菌株要求不改变发酵特性，选育出的抗噬菌体菌株有相当的变异性，很可能变异为敏感菌，且噬菌体本身也会变异，要合理使用抗性菌体。第91页/共99页92采取专一性不同的生产菌株采取药物防治的办法，在生产已受到噬菌体的威胁和侵染时，可采用药物防治。可利用螯合剂：如柠檬酸盐等，可抑制噬菌
49、体的吸咐和DNA的注入。表面活性剂：如吐温等，可抑制噬菌体的吸附。抗生素：如氯霉素，可抑制噬菌体蛋白质合成聚胺类：可抑制噬菌体的活化。第92页/共99页934、挽救被噬菌体污染的方法、挽救被噬菌体污染的方法种子罐：重消、倒罐、空消前期：补料、重消、温度可低一点（80-90,10）可接入抗性菌株。也可采用对压法：噬菌体最易在生产繁殖旺盛时侵入菌体中后期：一般采用加热处理，再提取，其适合于产物要耐热，不是热解产物。只要染了噬菌体都要灭菌，最好用甲醛重蒸。第93页/共99页94第94页/共99页95第95页/共99页96第96页/共99页97第97页/共99页98第98页/共99页99感谢您的观看！第99页/共99页