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1、会计学1酶学酶的分离纯化与制剂酶学酶的分离纯化与制剂第一节第一节 酶分离纯化的一般原则酶分离纯化的一般原则 预防蛋白质变性失效的方法与措施预防蛋白质变性失效的方法与措施 主要内容：主要内容：防止酶变性失效防止酶变性失效 选择有效的纯化方法选择有效的纯化方法 酶活性测定贯穿纯化过程的始终酶活性测定贯穿纯化过程的始终第1页/共72页主讲教师：赵丹丹3一、酶分离纯化的概述一、酶分离纯化的概述n n酶工业生产中属于酶工业生产中属于下游下游技术！技术！n n最终目的（最终目的（）n n整个工作包括三个基本环节：整个工作包括三个基本环节：(1)(1)抽提抽提（extractionextraction）：是
2、要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；(2)(2)纯化纯化（purificationpurification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；(3)(3)制剂制剂（preparationpreparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。获得高度纯净的酶制剂获得高度纯净的酶制剂第2页/共72页主讲教师：赵丹丹4一、酶分离纯化的概述一、酶分离纯
3、化的概述3.3.酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点：酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点：(1)(1)特定的一种酶在细胞中的含量很少；特定的一种酶在细胞中的含量很少；(2)(2)酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。给纯化带来了麻烦给纯化带来了麻烦迅速找出纯化过程的关键迅速找出纯化过程的关键第3页/共72页主讲教师：赵丹丹5二、防止酶变性失效二、防止酶变性失效n n除了少数例外，所有操作都必须在除了少数例外，所有操作都必须在低温条件低温条件下进行，特别是在有下进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心；机溶剂存在的情况下更应小心；n n大多数酶在大多数酶在pHp
4、H4 4或或pHpH1010的情况下不稳定，应控制整个的情况下不稳定，应控制整个系统不系统不要过酸、过碱要过酸、过碱，同时要避免在调整，同时要避免在调整pHpH时产生局部酸碱过量；时产生局部酸碱过量；n n酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量故操作时要尽量减少泡沫形成减少泡沫形成；n n重金属重金属等能引起酶失效，等能引起酶失效，有机溶剂有机溶剂能使酶变性，能使酶变性，微生物微生物污染以及污染以及蛋白水解酶蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视
5、。第4页/共72页主讲教师：赵丹丹6三、选择有效的纯化方法三、选择有效的纯化方法n n酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶包括其他酶)尽可能地尽可能地除去，因而，容许在除去，因而，容许在不破坏待纯化的不破坏待纯化的“目的酶目的酶”的限度内，使用的限度内，使用各种各种“激烈激烈”手段手段。n n由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种应用各种亲和分离法亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变
6、化。这样又扩大了纯化方法与和稳定性往往会发生一些有利的变化。这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。纯化条件的选择范围。第5页/共72页主讲教师：赵丹丹7四、酶活性测定贯穿纯化过程的四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终始终n n酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据选择适当的方法与条件提供直接的依据。n n从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就
7、能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定决定其取舍其取舍。第6页/共72页第二节第二节 酶的抽提酶的抽提抽提的要求是要将尽可能多的酶、抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。尽量少的杂质从原料引入溶液。主要内容：主要内容：预处理和破细胞预处理和破细胞 抽提抽提 浓缩浓缩第7页/共72页主讲教师：赵丹丹9一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞n n着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理着手酶的提取前，
8、通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)(Pretreatmention)。例如：。例如：(1)(1)动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ；(2)(2)油质种子最好先用乙醚等脱脂；油质种子最好先用乙醚等脱脂；(3)(3)种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染；(4)(4)对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。2.2.在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用;否则，应将完整
9、材料立即冰冻保存。否则，应将完整材料立即冰冻保存。第8页/共72页主讲教师：赵丹丹10一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞3.3.根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。(1)(1)细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；(2)(2)细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。存在状态以及细胞破碎的程度有关。n n 周质酶周质酶”（per
10、iplasmic enzymeperiplasmic enzyme）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放；）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放；n n“膜结合酶膜结合酶（membrane-binding enzymemembrane-binding enzyme）则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问）则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题。题。第9页/共72页主讲教师：赵丹丹11一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞4.4.细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）(1)(1)机械破碎法机械破碎法n n机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器机械捣
11、碎法，绞肉机、高速组织捣碎器n n研磨法研磨法n n匀浆法匀浆法pp高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效；高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效；pp加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。pp在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶解处理。解处理。第10页/共72页主讲教师：赵丹丹12一、预处理和破细胞
12、一、预处理和破细胞4.4.细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）(2)(2)丙酮干粉丙酮干粉（acetone powderacetone powder）处理法）处理法pp适用于微生物材料适用于微生物材料pp一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0 0以下的低温条件下、加入以下的低温条件下、加入5 51010倍预先冷至约倍预先冷至约-2020的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛pp丙酮处理优点：丙酮处理优点：能有效地破坏细胞壁（膜）；能有效地破坏细
13、胞壁（膜）；有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰；扰；能使某些膜结合酶易于溶解；能使某些膜结合酶易于溶解；丙酮干粉含水量低，便于保存。丙酮干粉含水量低，便于保存。pp缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。第11页/共72页主讲教师：赵丹丹13一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞4.4.细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）(3)(3)物理破碎法物理破碎法温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法；渗透压差法压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法
14、；渗透压差法超声波破碎法超声波破碎法(4)(4)化学破碎法化学破碎法n n有机溶剂处理有机溶剂处理n n表面活性剂处理表面活性剂处理(5)(5)酶法破碎法酶法破碎法外加酶处理外加酶处理自溶法自溶法(Autolysis)(Autolysis)p 所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与温度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。溶液化。p 有人认为不是好方法，理由是：有人认为不是好方法，理由是：第一，自溶液中成分十分复杂；第一，自溶液中成分十
15、分复杂；第二，有破坏目的酶的危险。第二，有破坏目的酶的危险。第12页/共72页主讲教师：赵丹丹14一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞4.4.细胞破碎（细胞破碎（cell disruptioncell disruption）(6)(6)注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。pp霉菌：易处理霉菌：易处理pp细菌：细菌：少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中，细菌材料可以用细菌磨少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中，细菌材料可以用细菌磨或挤榨器等处理。或挤榨器等处理。pp酵母酵母：由于其壁厚较难对付，过去多用自
16、溶法，后来采用的办法有：由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法，后来采用的办法有：细胞壁溶解酶处理法；细胞壁溶解酶处理法；稀盐溶液振荡法；稀盐溶液振荡法；冷热破壁法。冷热破壁法。第13页/共72页主讲教师：赵丹丹15二、抽二、抽 提提1.1.抽提方式抽提方式(1)“(1)“普遍普遍”抽提；抽提；(2)(2)选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。2.2.由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择则取决于酶的溶解性、液。但抽提液的具体组成和抽
17、提条件的选择则取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。3.3.酶提取的主要方法酶提取的主要方法(1)(1)盐溶液提取盐溶液提取(2)(2)酸、碱溶液的提取酸、碱溶液的提取(3)(3)有机溶剂提取有机溶剂提取第14页/共72页主讲教师：赵丹丹16二、抽二、抽 提提4.4.酶提取的注意事项酶提取的注意事项(1)pH(1)pHpp应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的pHpH不能超出酶的稳定范围。不能超出酶的稳定范围。pp从最佳的抽提效果而言，选择的从最佳的抽提效果而言，选择的pHpH最好远离目的酶的等电
18、点。也就是说，酶如果是酸性蛋白最好远离目的酶的等电点。也就是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如胰蛋白酶的抽提，通常选质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如胰蛋白酶的抽提，通常选用用0.125mol/L0.125mol/L的硫酸，这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的的硫酸，这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的杂质也较少。杂质也较少。pp考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用pH4pH46 6为佳。为佳。第
19、15页/共72页主讲教师：赵丹丹17二、抽二、抽 提提4.4.酶提取的注意事项酶提取的注意事项(2)(2)盐盐pp大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以，抽提液一般采用等渗盐溶液，最大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以，抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的有普通的有0.0200.0200.05mol/L0.05mol/L的磷酸缓冲液，的磷酸缓冲液，0.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl溶液等。溶液等。pp焦磷酸钠溶液和柠檬酸钠缓冲液，由于有助于切断酶和其他物质的联系，并有整合某些金属焦磷酸钠溶液和柠檬酸钠缓冲液，由于有助于切断酶和其他物质的联系，并有整
20、合某些金属的作用，因此用得也很多。的作用，因此用得也很多。pp某些报道表明，少数情况下，如抽提霉菌脂肪酶，用水的效果亦佳，这可能与低渗可破坏细某些报道表明，少数情况下，如抽提霉菌脂肪酶，用水的效果亦佳，这可能与低渗可破坏细胞结构有关。胞结构有关。第16页/共72页主讲教师：赵丹丹18二、抽二、抽 提提4.4.酶提取的注意事项酶提取的注意事项(3)(3)温度温度pp通常，抽提温度多控制在通常，抽提温度多控制在0 04 4左右。如果待纯化的酶比较稳定，则可以例外。左右。如果待纯化的酶比较稳定，则可以例外。pp例如，胃蛋白酶就可在例如，胃蛋白酶就可在3737条件下保温抽提。条件下保温抽提。第17页/
21、共72页主讲教师：赵丹丹19二、抽二、抽 提提4.4.酶提取的注意事项酶提取的注意事项(4)(4)其他其他pp破细胞时，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。破细胞时，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。因此，有时在抽提液中还需要加入某些物质。因此，有时在抽提液中还需要加入某些物质。pp例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟（例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟（PMSFPMSF），为防止氧化等因素的），为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。第
22、18页/共72页主讲教师：赵丹丹20二、抽二、抽 提提5.5.结合紧密的结酶结合紧密的结酶pp常以脂蛋白络合物形式存在。常以脂蛋白络合物形式存在。pp有的在做成丙酮粉末以后就可抽出，有的则需要使用较强烈的手段，用正丁醇等处理。有的在做成丙酮粉末以后就可抽出，有的则需要使用较强烈的手段，用正丁醇等处理。正丁正丁醇的特点醇的特点是兼具高度的亲水性和亲脂性是兼具高度的亲水性和亲脂性(特别是磷脂特别是磷脂)，能破坏酶与脂蛋白的连结使酶进入溶，能破坏酶与脂蛋白的连结使酶进入溶液。液。pp近年来广泛采用的还有各种表面活性剂和去污剂，如胆酸盐、近年来广泛采用的还有各种表面活性剂和去污剂，如胆酸盐、Trito
23、nTriton、ToweenToween等，它们常用于等，它们常用于抽提呼吸链系统的酶系。抽提呼吸链系统的酶系。第19页/共72页主讲教师：赵丹丹21二、抽二、抽 提提6.6.抽提液抽提液(1)(1)用量用量通常为原料量的通常为原料量的1 15 5倍，有时为了提高抽提效果，要进行反复抽提，这样，液量就可能倍，有时为了提高抽提效果，要进行反复抽提，这样，液量就可能大些。大些。(2)(2)抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成分抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成分一般可用离心法或压滤法除去，植物原料的抽提液在一般可用离心法或压滤法除去，植物原料的抽提液在冷室中放置过夜往往就会自动澄清。冷室中放置过夜往往就
24、会自动澄清。某些情况下，在进行抽提液离心前，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质，常有助于除去悬某些情况下，在进行抽提液离心前，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质，常有助于除去悬浮的胶体物质。浮的胶体物质。第20页/共72页主讲教师：赵丹丹22典型的抽提液组成成分典型的抽提液组成成分典型的抽提液组成成分典型的抽提液组成成分常见抽提液成分常见抽提液成分作作 用用KCl,NaCl,蔗糖蔗糖各种缓冲液各种缓冲液甘油、甘油、DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜)PMSF(苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟)DTT,巯基乙醇巯基乙醇EDTA,柠檬酸柠檬酸TritonX-100(聚乙二醇辛基苯聚乙二醇辛基苯基醚基醚,中文名为曲
25、拉通中文名为曲拉通X-100)0.15mol/L KCl0.3mol/L 蔗糖蔗糖离子强度调节剂离子强度调节剂pH缓冲剂缓冲剂温度效应剂温度效应剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂抗氧化剂抗氧化剂重金属络合剂重金属络合剂增溶剂增溶剂第21页/共72页主讲教师：赵丹丹23二、抽二、抽 提提7.7.新技术新技术pp“扩展床吸附层析扩展床吸附层析”（expanded bed adsorption chromatographyexpanded bed adsorption chromatography）pp商品名：商品名：STREAMLINESTREAMLINEpp简化分离纯化工作，开发了一种将抽提液的分离和相
26、继的纯化步骤结合在一起的技术简化分离纯化工作，开发了一种将抽提液的分离和相继的纯化步骤结合在一起的技术pp通过这一技术人们可以直接从含有颗粒体的物料，如发酵液、细胞破碎液中截获所需要的蛋通过这一技术人们可以直接从含有颗粒体的物料，如发酵液、细胞破碎液中截获所需要的蛋白质或酶，移去颗粒成分，从而免除了离心、过滤，甚至浓缩等繁复的下游（白质或酶，移去颗粒成分，从而免除了离心、过滤，甚至浓缩等繁复的下游（downstreamdownstream）步骤。步骤。第22页/共72页主讲教师：赵丹丹24三、浓三、浓 缩缩n n抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进行纯化抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很
27、低，所以在进行纯化前往往须先加以浓缩前往往须先加以浓缩 (Concentration)(Concentration)n n作用：作用：(1)(1)每一步的回收率升高；每一步的回收率升高；(2)(2)酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。第23页/共72页主讲教师：赵丹丹25三、浓三、浓 缩缩3.3.常用的浓缩的方法有以下几种常用的浓缩的方法有以下几种(1)(1)蒸发蒸发 (Evaporation)(Evaporation)减压蒸发浓缩法减压蒸发浓缩法：效率低、费时间、要加热、产泡沫、易变性，不：效率低、费时间、要加热、产泡沫、易变性，不能用于稳定性较差
28、的酶。同时，蒸发过程还可能出现增色现象，影能用于稳定性较差的酶。同时，蒸发过程还可能出现增色现象，影响产品的质量响产品的质量超蒸发浓缩法超蒸发浓缩法：让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通：让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳薄膜蒸发浓缩薄膜蒸发浓缩：现在应用较多：现在应用较多第24页/共72页主讲教师：赵丹丹26三、浓三、浓 缩缩3.3.常用的浓缩方法常用的浓缩方法(1)(1)蒸发蒸发pp薄膜蒸发浓缩薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的，即将待浓缩的酶溶液在高度真空
29、条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。浓缩的目的。薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。对于较粘稠的对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增色现象。样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增色现象。第25页/共72页主讲教师：赵丹丹27三、浓三、浓 缩缩3.3.常用的浓缩方法常用的浓缩方法(2)(2)超过滤（超过滤（ultrafiltrationultrafiltration）pp在加压情况下，将待浓缩液通
30、过一层只允许水分子和小分子选择性在加压情况下，将待浓缩液通过一层只允许水分子和小分子选择性透过的微孔滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一透过的微孔滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一种技术。种技术。pp优点：优点：没有破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和没有破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和pHpH；如果膜选择；如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分，成本也不高，故为人们所乐适当，浓缩过程还可能同时进行粗分，成本也不高，故为人们所乐用。用。pp超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超过
31、滤装置可供选择。过滤装置可供选择。第26页/共72页主讲教师：赵丹丹28三、浓三、浓 缩缩3.3.常用的浓缩方法常用的浓缩方法(3)(3)胶过滤胶过滤 (gel filtrationgel filtration)pp利用葡聚糖凝胶利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50等能吸水膨润，而酶等大分子等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。被排阻于胶外的原理进行的浓缩。pp通常采用通常采用“静态静态”方式，应用这种方法时，胶吸水膨润一定时间后，方式，应用这种方法时，胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分出浓缩的酶溶液。再借助过滤或
32、离心等办法分出浓缩的酶溶液。pp优点：优点：条件温和；操作简便；没有条件温和；操作简便；没有pHpH与离子强度等的改变。与离子强度等的改变。第27页/共72页主讲教师：赵丹丹29三、浓三、浓 缩缩3.3.常用的浓缩方法常用的浓缩方法(4)(4)反复冻融反复冻融 (freeze-thawingfreeze-thawing)pp溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。pp主要方式：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块将浮主要方式：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块将浮于液面，而酶等则融
33、解并集中于下层溶液于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右至原体积的四分之一左右)pp主要问题：浓缩过程可能会发生离子强度与主要问题：浓缩过程可能会发生离子强度与pHpH的变化，从而导致酶失效。反复冻融实际上最的变化，从而导致酶失效。反复冻融实际上最好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通常都是反复冻好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通常都是反复冻融后超声波处理，效果较好。融后超声波处理，效果较好。第28页/共72页主讲教师：赵丹丹30四、生物材料的选择四、生物材料的选择n n来源来源:动物动物,植物和微生物及其代
34、谢产物植物和微生物及其代谢产物n n选择材料的要求选择材料的要求(1)(1)从工业生产角度，来源丰富从工业生产角度，来源丰富,含量较高含量较高,制备工艺简单制备工艺简单,生产成本较低，不能同生产成本较低，不能同时具备时抓住主要矛盾决定取舍；时具备时抓住主要矛盾决定取舍；(2)(2)从科研工作的角度，只须符合实验预定的目标要求从科研工作的角度，只须符合实验预定的目标要求;(3)(3)植物材料要注意季节性、地理位置和生长环境等植物材料要注意季节性、地理位置和生长环境等;(4)(4)动物材料时要注意年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等动物材料时要注意年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等;
35、(5)(5)微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分等。微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分等。n n材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存。保存。第29页/共72页第三节第三节 酶的纯化原理与方法酶的纯化原理与方法 主要内容：主要内容：根据溶解度不同、分子大小不同、根据溶解度不同、分子大小不同、电学解离性质、专一亲和作用等。电学解离性质、专一亲和作用等。第30页/共72页主讲教师：赵丹丹32一、一、纯化工作纯化工作前的准备前的准备n n明确抽提液中的杂质成分明确抽提液中的杂质成分目的酶目的酶 +小分子杂质小
36、分子杂质 +大分子杂质大分子杂质(1)(1)小分子杂质一般会自然地除去，比较容易解决小分子杂质一般会自然地除去，比较容易解决(2)(2)大分子杂质包括大分子杂质包括核酸、粘多糖和杂蛋白核酸、粘多糖和杂蛋白pp核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶;pp粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决，有时也可用酶；粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决，有时也可用酶；pp杂蛋白的去除是纯化的主要工作，也是比较困难的工作杂蛋白的去除是纯化的主要工作，也是
37、比较困难的工作第31页/共72页主讲教师：赵丹丹33一、一、纯化工作纯化工作前的准备前的准备n n为了获得较理想的分离效果的注意问题为了获得较理想的分离效果的注意问题(1)(1)工作前全面了解所要纯化的酶的理化性质工作前全面了解所要纯化的酶的理化性质n n在水和各种有机溶剂中的溶解性在水和各种有机溶剂中的溶解性;n n在不同温度、在不同温度、pHpH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性;n n固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性;n n各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场各种物理性质：如分子的大小、穿膜的
38、能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等数等;n n其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性剂的稳定性;n n对其他生物分子的特殊亲和力等。对其他生物分子的特殊亲和力等。这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理、这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理、以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。第32页/共72页主讲教师：赵丹丹3
39、4一、一、纯化工作纯化工作前的准备前的准备n n为了获得较理想的分离效果的注意问题为了获得较理想的分离效果的注意问题(2)(2)判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活 力测定为力测定为准则。准则。n n一个好的步骤应该是比活力（纯度）提高大、总活力回收高，而且一个好的步骤应该是比活力（纯度）提高大、总活力回收高，而且重现性好重现性好;n n一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。第33页
40、/共72页主讲教师：赵丹丹35一、一、纯化工作纯化工作前的准备前的准备n n为了获得较理想的分离效果的注意问题为了获得较理想的分离效果的注意问题(3)(3)要严格控制操作条件。要严格控制操作条件。n n可保证高的重复率可保证高的重复率;n n可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，酶的稳定性也因之降低，这一点尤为重要。酶的稳定性也因之降低，这一点尤为重要。第34页/共72页主讲教师：赵丹丹36一、一、纯化
41、工作纯化工作前的准备前的准备n n纯化方法纯化方法(1)(1)依据：酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异依据：酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异;酶的生物特性酶的生物特性(2)(2)现有方法：现有方法：n n根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。n n根据分子大小的差别，有胶过滤根据分子大小的差别，有胶过滤(层析层析)法、超过滤法及超离心法等。法、超过滤法及超离心法等。n n根据电学、解离性质，有吸附根据电学、解离性质，有吸附(层析层析)法、离子交换层析法、电泳法以及集层析法、离子交换层析法
42、、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。与电泳之长的聚焦层析法等。n n基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法等。亲和分离法等。n n利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用第35页/共72页主讲教师：赵丹丹37二、根据溶解度不同进行纯化二、根据溶解度不同进行纯化n n盐析法盐析法n n有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n n共
43、沉淀法共沉淀法n n选择性沉淀法选择性沉淀法n n等电点沉淀法等电点沉淀法n n液液-液分离法液分离法n n萃取分离法萃取分离法沉淀分离法：沉淀分离法：改变某些条件或添加某种物质，改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度较低，使酶在溶液中的溶解度较低，从溶液中析出。从溶液中析出。第36页/共72页主讲教师：赵丹丹38*盐析法盐析法(1)(1)原理：酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别原理：酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别(2)(2)常用盐：硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠等常用盐：硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠等(3)(3)公式公式n n不同的盐对某种蛋白质具有不
44、同的盐析常数；不同的盐对某种蛋白质具有不同的盐析常数；同一种盐对不同种蛋白质有不同的盐析常数。同一种盐对不同种蛋白质有不同的盐析常数。n n分段盐析：分段盐析：Ks;Ks;(4)(4)影响因素影响因素(5)(5)饱和饱和硫酸铵硫酸铵第37页/共72页主讲教师：赵丹丹39补补 萃取分离法萃取分离法(1)(1)萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，利用相似相溶原萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，利用相似相溶原理。理。(2)(2)两相一般为互不相溶的两个液相，按照组成不同分为：两相一般为互不相溶的两个液相，按照组成不同分为：n n有机溶剂萃
45、取：乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等有机溶剂萃取：乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等n n液膜萃取：液膜是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液液膜萃取：液膜是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液隔开，并通过渗透现象起到分离的作用。乳液微粒通常是由溶剂隔开，并通过渗透现象起到分离的作用。乳液微粒通常是由溶剂(水和有机溶剂水和有机溶剂)、表面活性、表面活性剂和添加剂制成的。剂和添加剂制成的。n n双水相萃取双水相萃取n n超临界萃取超临界萃取第38页/共72页主讲教师：赵丹丹40三、按照分子大小进行的纯化三、按照分子大小进行的纯化n n胶过滤（层析）法胶过滤（
46、层析）法n n筛膜分离法筛膜分离法n n超速离心分离法超速离心分离法过滤分离法：过滤分离法：借助于过滤介质将不同大小、不同借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程形状的物质分离的技术过程;滤纸、纤维、多孔陶瓷、烧结金属滤纸、纤维、多孔陶瓷、烧结金属;第39页/共72页主讲教师：赵丹丹41类别类别截留的颗粒大小截留的颗粒大小截留的主要物质截留的主要物质过滤介质过滤介质粗滤粗滤 微滤微滤 超滤超滤反渗透反渗透 2m0.22m2nm 0.2m2nm酵母、霉菌、细胞酵母、霉菌、细胞细菌、灰尘细菌、灰尘病毒、生物大分子病毒、生物大分子生物小分子、盐、离子生物小分子、盐、离子 上述上述微滤膜
47、微滤膜超滤膜超滤膜反渗透膜反渗透膜过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性第40页/共72页主讲教师：赵丹丹42*胶过滤（层析）法胶过滤（层析）法(1)(1)原理原理(2)(2)胶的选择：定义、种类胶的选择：定义、种类(3)(3)柱层析的基本过程与要求柱层析的基本过程与要求第41页/共72页主讲教师：赵丹丹43四、建立在电学解离性质进行的四、建立在电学解离性质进行的纯化纯化n n吸附交换（层析）吸附交换（层析）n n电泳分离法电泳分离法n n聚焦层析聚焦层析n n快速液相层析快速液相层析n n疏水层析疏水层析第42页/共72页主讲教师：赵丹丹44*电泳分离法电泳
48、分离法成层胶（成层胶（spacer胶或称胶或称stack胶）胶）分离胶（分离胶（separate胶或称胶或称run胶）胶）第43页/共72页主讲教师：赵丹丹45五、利用专一亲和作用进行的纯五、利用专一亲和作用进行的纯化化n n亲和层析法亲和层析法n n亲和电泳法亲和电泳法n n融合蛋白亲和分离法融合蛋白亲和分离法n n其他相关的亲和分离法其他相关的亲和分离法第44页/共72页主讲教师：赵丹丹46*融合蛋白亲和分离法融合蛋白亲和分离法(1)(1)亲和层析中常用作配基的物质亲和层析中常用作配基的物质(2)(2)常用融合蛋白标签常用融合蛋白标签第45页/共72页主讲教师：赵丹丹47六、根据稳定性差别
49、建立的纯化六、根据稳定性差别建立的纯化n n选择性热变性（选择性热变性（selective heat denaturationselective heat denaturation）n n选择性酸碱变性法选择性酸碱变性法n n表面变性法表面变性法第46页/共72页主讲教师：赵丹丹48七、结晶七、结晶n n所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，规则且周期性排所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，规则且周期性排列的一种固体形式。列的一种固体形式。n n由于不纯的蛋白溶液、变性的蛋白质不能和酶形成结晶，各种分子形由于不纯的蛋白溶液、变性的蛋白质不能和酶形成结晶，各种分子形成结晶的条件
50、也不同，因此，结晶成结晶的条件也不同，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是既是一种酶是否纯净的标志，也是一种分离纯化的手段一种分离纯化的手段。n n结晶也是利用酶和杂蛋白在溶解度上不同而进行的一种纯化方法，但结晶也是利用酶和杂蛋白在溶解度上不同而进行的一种纯化方法，但是和其他利用溶解度降低的方法不同，它要求以极为是和其他利用溶解度降低的方法不同，它要求以极为缓慢缓慢的速度逐渐的速度逐渐降低酶的溶解度，使之能从溶解状态以特定的固体形式析式。降低酶的溶解度，使之能从溶解状态以特定的固体形式析式。n n为获得纯净为获得纯净,粒大粒大,收得率又高的结晶，有两个重要因素收得率又高的结晶，有两个重要因