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1、会计学1细胞培养相关技术细胞培养相关技术体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性n n 培养细胞的生长方式 贴附生长：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，如各种实必须贴附于支持物表面才能生长，如各种实体瘤细胞。体瘤细胞。悬浮生长：悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，如各种造血系统肿瘤细胞。物表面，如各种造血系统肿瘤细胞。细胞培养：模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。第1页/共61页基本概念基本概念n n原代培养原代培养原代培养原代培养 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞
2、经体外培养后可贴壁或动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。悬浮生长，在传代之前称为原代培养。n n传代传代传代传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。细胞系细胞系 cell line cell line 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finite cell linefinite cell line）；已获无限）；已获无限繁殖能力
3、能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinite cell lineinfinite cell line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。细胞株细胞株 cell strain cell strain 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通养或通过筛选的方法，由
4、单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。第2页/共61页n n美国标准细胞库或细胞银行（美国标准细胞库或细胞银行（ATCCATCC）和人遗传突变细）和人遗传突变细胞库（胞库（HGMRHGMR）、细胞衰老细胞库（）、细胞衰老细胞库（CARCAR）等）等n nATCCATCC不仅是美国，也是世界最大的细胞库，是世界卫不仅是美国，也是世界最大的细胞库，是世界卫生组织生组织WHOWHO的国际培养细胞文献中心的国际培养细胞文献中心n nATCCATCC现液氮冻存有现液氮冻存有32003200个已经过鉴定的细胞系，接纳个已
5、经过鉴定的细胞系，接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）利性研究时收费）n n武汉大学细胞典藏物中心武汉大学细胞典藏物中心细胞典藏物中心第3页/共61页每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程n n游离期游离期n n贴壁期贴壁期n n潜伏期潜伏期n n对数生长期对数生长期n n停止期（平台期）停止期（平台期）第4页/共61页游离期：游离期：n n细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此细胞接种后在培养液中呈悬浮状态
6、也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n n1010分钟一分钟一4 4小时小时第5页/共61页贴壁期：贴壁期：n n细胞附着于细胞附着于底物底物上，游离期结束。细胞株平均在上，游离期结束。细胞株平均在1010分钟一分钟一4 4小时小时贴壁。贴壁。n n底物底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促
7、贴壁因子的附着。底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n n进口塑料培养瓶涂有进口塑料培养瓶涂有生长基质生长基质（化学合成的功能基团）（化学合成的功能基团）第6页/共61页第7页/共61页潜伏期潜伏期n n此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。n n细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为6 62424小时。小时。第8页/共61页对数生长期：对数生长期：n n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。第9页/共61页停止期（平台期）停止期（平台期）：n n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
8、细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n n机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性第10页/共61页细胞培养方式细胞培养方式 n n群体培养（群体培养（massculturemassculture），将含有一定数量细胞的悬液），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层细胞层n n克隆培养（克隆培养（clonalcultureclonalculture），将高度稀释的游离细胞悬），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经
9、过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（cloneclone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。祖先细胞。第11页/共61页群体培养（左）和克隆培养（右）第12页/共61页培养细胞生长的条件培养细胞生长的条件n n无污染环境无污染环境:生物安全柜，超净工作台生物安全柜，超净工作台n n基质基质:玻璃，塑料玻璃，塑料n n营养需要营养需要:氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素 (商商业化合成培养基业化合成培养基)n npH:7.2-7
10、.4pH:7.2-7.4n n温度温度:37:37，细胞培养箱，细胞培养箱n n气体环境气体环境 OO2 2 CO CO2 2:5%CO:5%CO2 2+H+H2 2O HO H2 2COCO3 3 H H+HCO3+HCO3-第13页/共61页实验准备实验准备实验用品：实验用品：实验用品：实验用品：n n超超超超净净净净工工工工作作作作台台台台，压压力力蒸蒸汽汽消消毒毒器器，电电热热干干燥燥箱箱，滤滤器器，酸酸缸，紫外灯，甲醛熏蒸器缸，紫外灯，甲醛熏蒸器n nCOCO2 2培养箱培养箱培养箱培养箱n n倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜倒置显微镜n n酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器n
11、n液氮液氮罐罐n n自动双重纯水蒸馏器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪纯水仪纯水仪纯水仪n n耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板，冻存管冻存管n n。第14页/共61页CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定的条件为37，5CO2。n使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h或者紫外杀菌)。箱内置4-6L蒸馏水，加入100ml饱和硫酸铜溶液，以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发，并抑制真菌污染。第15页/共61页实验物品准备 常用玻璃器皿清洗n n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉
12、）、泡酸（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（2424小时）、小时）、小时）、小时）、n n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、5050烘干烘干烘干烘干第16页/共61页清洁液的配制清洁液的配制第17页/共61页细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：平衡盐溶液：无无CaCa2+2+、MgMg2+2+的缓冲液的缓冲液 PBSPBS：NaCl 8.0 gNaCl 8.0 g KCl 0.2 g
13、KCl 0.2 g Na Na2 2HPOHPO4 4.H.H2 2O 1.56 gO 1.56 g KH KH2 2POPO4 4 0.20 0.20 加水至加水至1000 ml1000 ml第18页/共61页消化液n n胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽健健，除除去去细细胞胞间间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。n n胰蛋白酶液浓度胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n n胰胰蛋蛋白白酶酶是是一一种种黄黄白白色色粉粉末末，用用
14、无无CaCa2+2+、MgMg2+2+的的PBSPBS缓缓冲冲液液配配制制常常用的胰蛋白酶液浓度是用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25 。用滤器过滤除菌。用滤器过滤除菌。n n胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。n n用含血清培养液终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 第19页/共61页培养基培养基n n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。培养基。n n合成培养基：合成培养基：合成培养基：合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人
15、工方法模拟合成的。根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-1640RPMI-1640、DMEMDMEM等。等。n n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。量的天然培养基（如血清）。第20页/共61页血清中含有：血清中含有：n n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n n多种金属离子多种金属离子n n激素激素n n促贴附物
16、质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等n n各种生长因子各种生长因子n n转移蛋白转移蛋白n n不明成分不明成分n n一一般般说说来来，含含5 5小小牛牛血血清清的的培培养养基基对对大大多多数数细细胞胞可可以以维维持持细细胞胞不死，但支持细胞生长一般需加不死，但支持细胞生长一般需加 1010血清。血清。第21页/共61页n n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、优质血清的标
17、准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。支原体、病毒污染。n n血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 56 ，30 30 分钟分钟n n血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌第22页/共61页抗生素的使用n n在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。可能存在的细菌的生长。n n通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升链霉素最终使用浓度为每毫升100100单位。单位。n n庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升1
18、00100单位单位方便、广谱、稳定方便、广谱、稳定第23页/共61页完全培养基的组成完全培养基的组成n n基础培养基基础培养基 8080一一9595n n血清血清 5 5一一2020n n碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/L2.0 g/Ln n青、链霉素青、链霉素 各各100100单位毫升单位毫升第24页/共61页细胞培养基本方法（无菌原则）细胞培养基本方法（无菌原则）n n无菌工作台用无菌工作台用75%75%酒精擦拭干净，紫外线照射酒精擦拭干净，紫外线照射4040分钟以分钟以上。上。n n清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%75%酒精擦拭。酒精擦拭。n n操
19、作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。严格注意无菌操作。第25页/共61页细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有3 3种。种。n n悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n n半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象
20、，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。壁脱落下来，进行传代。n n贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。第26页/共61页贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法n n吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液n n适量适量PBSPBS洗净残留培养液洗净残留培养液n n加入加入1-2 ml 0.251-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）以消化液能覆盖整个瓶底为准）n n
21、静置静置2-10 min2-10 min（显微镜下动态监测）（显微镜下动态监测）n n加入培养液，终止胰酶消化作用加入培养液，终止胰酶消化作用n n用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液n n吸取吸取1/31/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内细胞悬液，接种于新的培养瓶内n n加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内n n将后者放入培养箱中培养将后者放入培养箱中培养第27页/共61页细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏n n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以细胞
22、低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第28页/共61页冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融n n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。浓度升高，并在细胞内形成冰晶。n n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损
23、伤和破裂。就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。n n复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第29页/共61页慢冻程序慢冻程序n n标准程序：标准程序：当温度在当温度在-25-25 以上时，以上时，1 12 2/min/min 当温度达当温度达-25-25 以下时，以下时，5 510 10/min/min 当温度达当温度达-100-100时，可迅速放入液氮中时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器细胞冻存器n n简易程序：简易程序：将将冷冷冻冻管管（管管口口要要朝朝上上）放放入入纱纱布布袋袋内内，纱纱布布袋袋系系
24、以以线线绳绳，通通过过线线绳绳将将纱纱布布袋袋固固定定于于液液氮氮罐罐罐罐口口，按按每每分分钟钟温温度度下下降降1 12 2 的的速速度度，在在4040分分钟钟内内降降至至液液氮氮表表面面，停停3030分分钟钟后后，直直接接投投人人液氮中。液氮中。第30页/共61页低温保护剂的应用低温保护剂的应用n n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n n常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSODMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水
25、分在冻结高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。的损伤。第31页/共61页细胞冻存方法细胞冻存方法n n预先配制冻存液：预先配制冻存液：含含20%20%血清培养基血清培养基n n 10%DMSO 10%DMSO n n取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（悬液（1101106 6 5 105 106 6细胞细胞/ml)/ml)n n
26、加入加入1ml1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期第32页/共61页细胞复苏方法细胞复苏方法n n从液氮中取出冷冻管，迅速投入从液氮中取出冷冻管，迅速投入373738 38 水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1 1分钟左右）。分钟左右）。n n5 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍以上。倍以上。n n低速离心低速离心1010分钟。分钟。n n去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第33页/共61页细胞计数细胞计数n n血细胞计数板n n计数仪 Counte
27、r 第34页/共61页血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。第35页/共61页培养细胞活力测定培养细胞活力测定n n台盼蓝法，trypanblue，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力n nMTT法第36页/共61页转染转染(Tr
28、ansfection)n n将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能在细胞内维持其生物功能 n n常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。核细胞的过程。第37页/共61页转染和转化的区别转染和转化的区别n n转化特指将质粒转化特指将质粒DNADNA或以其为载体构建的重组或以其为载体构建的重组DNADNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。种方法。第38页/共61页瞬时转染和稳定转染瞬时转染和稳定转染n n瞬时转染，外
29、源瞬时转染，外源DNA/RNADNA/RNA不整合到宿主染色体中，不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但平的表达，但 通常只持续几天。一般来说，在转染通常只持续几天。一般来说，在转染后后24-9624-96小时内检测和分析结果。小时内检测和分析结果。n n稳定转染，也称永久转染，外源稳定转染，也称永久转染，外源DNADNA整合到宿主染整合到宿主染色体中。外源色体中。外源DNADNA整合到染色体中概率很小，大约整合到染色体中概率很小，大约1/101/104 4转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记筛转染细胞能整合
30、，通常需要通过选择性标记筛选，如抗生素筛选选，如抗生素筛选APHAPH（新霉素抗性基因），（新霉素抗性基因），HPH HPH（潮霉素），（潮霉素），TKTK（胸苷激酶）等反复筛选，得到（胸苷激酶）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染的同源细胞系。第39页/共61页影响转染效率的因素影响转染效率的因素n n细胞培养物vv 健康的细胞健康的细胞vv 低的细胞代数（低的细胞代数（5050）能确保基因型不变）能确保基因型不变vv 一定的细胞密度一定的细胞密度vv 推荐在转染前推荐在转染前2424小时内分细胞，这将提供正常细小时内分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源胞代谢，增加对外源DNA
31、DNA摄入的可能摄入的可能第40页/共61页n n血清 vv血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。别。血清质量的变化直接影响转染效率。vv有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。率很低，因此在转染前要除血清。第41页/共61页n nDNADNA质量质量 vv一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引
32、原理，如果DNADNA不纯，如带少量的不纯，如带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国酸纯化世界第一品牌德国QIAGENQIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2xCsCl2xCsCl梯度离心以上的纯度效果，使梯度离心以上的纯度效果，使DNADNA质量得到保证。质量得到保证。vv对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGENQIA
33、GEN还提供还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。证理想的转染效果。第42页/共61页6孔板转染实验步骤孔板转染实验步骤n n转染前转染前1818至至2424小时内接种小时内接种2 2 10105 5细胞至每孔内（细胞浓度细胞至每孔内（细胞浓度1 1 10105 5/ml/ml，每孔接种，每孔接种2ml2ml，全培养基培养，无抗生素），转，全培养基培养，无抗生素），转染前染前4 4小时更换培养基小时更换培养基n n对每孔细胞，稀释对每孔细胞，稀释2ug DNA2ug
34、 DNA于于250 ul OptiMEM 250 ul OptiMEM n n对每孔细胞，稀释对每孔细胞，稀释4 ul Lipofectamine 20004 ul Lipofectamine 2000于于250 ul OptiMEM250 ul OptiMEM，室温孵育，室温孵育 5 min5 minn n将步骤将步骤2 2和步骤和步骤3 3中的中的DNADNA悬液和悬液和 Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000 悬液均悬液均匀混匀，室温孵育匀混匀，室温孵育20 min20 min以使以使 DNA-Lipofectamine 2000DNA-Lipofec
35、tamine 2000复合复合物形成物形成n n将将 DNA-Lipofectamine 2000 complexes(500 ul)DNA-Lipofectamine 2000 complexes(500 ul)直接轻柔的滴直接轻柔的滴加到每孔细胞中，轻柔摇匀加到每孔细胞中，轻柔摇匀第43页/共61页免疫荧光染色免疫荧光染色 IFn n免疫荧光组织（细胞）化学技术，是采用荧光素标记的已知抗体免疫荧光组织（细胞）化学技术，是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗
36、原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受紫外光照射，荧光素发出体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质。明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质。第44页/共61页n n直接法：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应直接法：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。原就需要制备一
37、种荧光抗体。n n间接法：特异性的一抗和荧光素标记的二抗间接法：特异性的一抗和荧光素标记的二抗第45页/共61页F-actin直接染色直接染色n n中文名称：中文名称：中文名称：中文名称：鬼笔环肽鬼笔环肽 n n英文名称：英文名称：英文名称：英文名称：phalloidin phalloidin n n定义：定义：定义：定义：由鬼笔鹅膏真菌（由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloidesAmanita phalloides）产生的一种环肽。可与）产生的一种环肽。可与F F肌动蛋肌动蛋白结合，使白结合，使F F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F F肌动
38、蛋白的重要试剂。肌动蛋白的重要试剂。第46页/共61页GFPTRITC-phalloidinDAPI07.23.1058,60,6162,64,6580,81,82第47页/共61页间接免疫荧光染色间接免疫荧光染色n n制片制片n n细胞接种细胞接种n n固定固定n n破膜破膜n n封闭封闭n n染色染色n n封片和荧光显微镜观察封片和荧光显微镜观察第48页/共61页制片制片n nChamber slideChamber slide：腔室玻璃系统：腔室玻璃系统n nCoverslipCoverslip：盖玻片（酒精，紫外照射灭菌）：盖玻片（酒精，紫外照射灭菌）n n玻片包被：胶原，纤维蛋白玻片
39、包被：胶原，纤维蛋白fibronectinfibronectin，整合素，整合素intergrinintergrin，vitronectin vitronectin *有些基质蛋白是与细胞内某些信号通路相关的有些基质蛋白是与细胞内某些信号通路相关的Chamber slide第49页/共61页细胞接种细胞接种n n根据不同的研究内容和实验目的，选择不同细胞密度进根据不同的研究内容和实验目的，选择不同细胞密度进行接种和生长时间行接种和生长时间n n染色前用温热的染色前用温热的PBSPBS洗去培养基（含洗去培养基（含CaCa2+2+、MgMg2+2+或者不或者不含含CaCa2+2+、MgMg2+2+
40、的的PBSPBS的选择）的选择）第50页/共61页固定固定n n根据需要选择适当的固定剂固定细胞，如根据需要选择适当的固定剂固定细胞，如4%4%多聚甲醛多聚甲醛 固定固定1515分钟分钟n n多聚甲醛宜现用现配，或配好后分装多聚甲醛宜现用现配，或配好后分装-20-20 冻存，用之冻存，用之前前37 37 复温复温n n固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBSPBS中中4 4保存保存3 3个个月月n nPBSPBS洗涤洗涤35 min35 min第51页/共61页破膜或通透破膜或通透n n在检测细胞内抗原表位的时候需要对细胞进行通透处理，因为抗在检测细胞内抗原表位的
41、时候需要对细胞进行通透处理，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白体需要进入细胞内部去检测蛋白n n如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透样需要对细胞进行通透n n如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。n n常用的通透剂是去垢剂，如常用的通透剂是去垢剂，如Triton Triton，NP-40NP-40，以及，以及Tween 20Tween 20，SaponinSaponin，Digitonin Digitonin 和和 Leu
42、copermLeucoperm等。等。n nTritonTriton和和NP-40NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。相关抗原。n n后面一组去垢剂要温和得多，它们
43、可以在细胞质膜上形成足够大后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。第52页/共61页封闭封闭n nPBST+1%BSA，室温，1h第53页/共61页抗体孵育抗体孵育n n为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。进行。n n二抗是荧光抗体，因此孵育时注意避光二抗是荧光抗体，因此孵育时注意避光 n n一抗室温
44、孵育一抗室温孵育1h1h，PBSTPBST洗涤洗涤3 35mim5mimn n二抗室温孵育二抗室温孵育1h1h，PBSTPBST洗涤洗涤3 35mim5mimn n核染：可在核染：可在PBSTPBST第二次洗涤时在第二次洗涤时在PBSTPBST中加入核染料如中加入核染料如DAPIDAPI（储存液用蒸馏水配成储存液用蒸馏水配成1mg/ml1mg/ml的浓度，使用终浓的浓度，使用终浓度一般为度一般为0.5 10.5 1 g/ml g/ml）第54页/共61页封片及荧光观察封片及荧光观察n n为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片（需
45、作封片（mountingmounting）处理）处理n n常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂剂 n n商业化的商业化的Mounting bufferMounting buffer有的已含有有的已含有DAPIDAPI，染核在封，染核在封片时即完成片时即完成第55页/共61页抗体选择抗体选择n nGFP+TRITC-GFP+TRITC-目标蛋白目标蛋白+DAPI+DAPIn nFITC-FITC-目标蛋白目标蛋白1+TRITC-1+TRITC-目标蛋白目标蛋白2+DAPI2+DAPI，应注意，应注意目标蛋白目标蛋白1 1和和2 2的荧光标记偶联的荧光标记偶联2 2抗的匹配抗的匹配第56页/共61页GFPMouse-cateninDAPI第57页/共61页Mouse-cateninRabbit ECSM2DAPI第58页/共61页第59页/共61页第60页/共61页