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1、会计学1细菌内毒素验证细菌内毒素验证2细菌内毒素验证基本程序细菌内毒素验证基本程序l l试验准备试验准备 确定样品内毒素限值确定样品内毒素限值 选择试剂选择试剂 计算计算MVD MVD 鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验 供试品干扰供试品干扰初筛试验初筛试验 干扰试验干扰试验 结果判断结果判断l l计算公式：计算公式：MVD=cL/MVD=cL/MVDMVD为供试品的最大有效稀释倍数，为供试品的最大有效稀释倍数，c c为供试品溶液的浓度，为供试品溶液的浓度，L L供试品的细菌供试品的细菌内毒素限值。如果计算在内毒素限值。如果计算在MVDMVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用时的
2、供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式公式MVc=MVc=/L./L.第1页/共11页3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验n n根据鲎试剂灵敏度的标示值（根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素工作标准品），将细菌内毒素工作标准品加入加入1ml1ml内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口内毒素检查用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合封严，置旋涡混合器上混合1515分钟。然后按所用的鲎试剂灵敏度分钟。然后按所用的鲎试剂灵敏度22、0.50.5、0.250.25进行进行稀释稀释。0.1ml0.1ml鲎试剂鲎试剂+0.1ml0.1ml标准品，平行标准品，平行4 4管；管；NCNC
3、：0.1ml0.1ml鲎试剂鲎试剂+0.1mlBET0.1mlBET用水，平行用水，平行2 2管管373711孵育孵育60min2min60min2min。n n结果判断：反应管缓缓倒转结果判断：反应管缓缓倒转180180，阳性（阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落；）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落；阴性（阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。实验有效：实验有效：NCNC管全部阴性（管全部阴性（-），），2.0 2.0 管全部阳性（管全部阳性（+），），0.250.25管全部阴性（管全部阴性（-）。l l数据处理：灵敏度测定值数
4、据处理：灵敏度测定值c=antilg(c=antilg(X/n)X/n)。X X：为反映终点浓度的对数值（：为反映终点浓度的对数值（lg),lg),反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。第2页/共11页4干扰试验预试验干扰试验预试验n n先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。n n例：某样品例：某样品C C：100100单位单位/ml L/ml L：0.8 EU/0.8 EU/单位单位 ：0.25 EU/ml0.25 EU/ml MVDMVD0.250.25=320=
5、320倍倍 MVC MVC0.250.25=/L=0.3125 =/L=0.3125 单位单位/ml MVC/ml MVC0.1250.125=/L=0.156=/L=0.156单位单位/ml /ml MVC MVC0.060.06=/L=0.078=/L=0.078单位单位/ml MVC/ml MVC0.030.03=/L=0.039 =/L=0.039 单位单位/ml/ml100100单位单位/ml20/ml20单位单位/ml10/ml10 单位单位/ml5/ml5 单位单位/ml2.5/ml2.5 单位单位/ml1.25/ml1.25 单位单位/ml0.625/ml0.625 单位单位/
6、ml0.3125/ml0.3125 单位单位/ml0.156ml/ml0.078/ml0.156ml/ml0.078 单位单位/ml0.039/ml0.039 单位单位/ml/ml分别用分别用44的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试品阳性对照。的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试品阳性对照。第3页/共11页5干扰试验预试验干扰试验预试验n n结果一结果一 供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验n n结果二结果二 供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验供试品在某浓度开
7、始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验供试品浓度供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液-供试品阳性对照+MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液-供试品阳性对照-+第4页/共11页6干扰试验预试验干扰试验预试验n n结果三结果三 假阳性，更换另一批供试品进行测试假阳性，更换另一批供试品进行测试l l结果四结果四假阴性，消除干扰后再测试假阴性，消除干扰后再测试供试品浓度供试品浓度MVC0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液+-供试品阳性对照+供试品浓度供试品浓度MVC
8、0.25MVC0.125MVC0.06MVC0.03BET水水供试品溶液-供试品阳性对照-+第5页/共11页7正式干扰试验正式干扰试验正式干扰试验正式干扰试验n n根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。编号编号内毒素浓内毒素浓度度/被加入被加入内毒素的内毒素的溶液溶液稀释用稀释用液液稀释稀释倍数倍数所含内毒所含内毒素的浓度素的浓度平行管平行管A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液12482 1 0.5 0.25 4444C2/检查用水检查用水12482 1 0.5 0.25 2222D无/检查用水2第6页/共11页
9、8正式干扰试验正式干扰试验正式干扰试验正式干扰试验n n上张表中，上张表中，A A为供试品溶液，为供试品溶液，B B为干扰试验系列；为干扰试验系列；C C为鲎试剂表示灵敏度的对照系列；为鲎试剂表示灵敏度的对照系列；DD为阴为阴性对照性对照n n只有当溶液只有当溶液A A和阴性对照溶液和阴性对照溶液DD的所有平行管都为阴性，并且系列溶液的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C C的结果符合鲎试剂灵的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。敏度复核试验要求时，试验方为有效。n n干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进
10、行试验第7页/共11页9干扰试验结果举例干扰试验结果举例干扰试验结果举例干扰试验结果举例 2（2）1（1）0.5（0.5）0.25（0.25）阴性对照 +-+-+-+-例1、批号1厂家1鲎试剂试验结果2、批号1厂家2鲎试剂试验结果3、重复做3批，计算结果 2（2）1（1）0.5（0.5）0.25（0.25）阴性对照 +-+-+-+-第8页/共11页10uu正式干扰试验接受标准正式干扰试验接受标准 当阴性对照当阴性对照4 4管为阴性，两组最大浓度管为阴性，两组最大浓度22均为阳性，最低浓度均为阳性，最低浓度0.250.25均为阴性时，均为阴性时，试验结果有效。试验结果有效。Et/EsEt/Es值
11、在值在0.50.52 2（包括（包括0.50.5、2 2）之间为无干扰，反之为有干）之间为无干扰，反之为有干扰扰uu正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（点浓度的几何平均值（ESES）和用供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的）和用供试品溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（几何平均值（EtEt）。）。uuE Es s=antiantilg lg (X(Xs s/4)/4)uuE Et t=antiantilg(Xlg(Xt t/4)/4)uuX Xs s，X Xt t分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg lg）。）。第9页/共11页11第10页/共11页