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1、精选优质文档-倾情为你奉上浅谈内质网生理和病理潘巍，胡刚（南京医科大学，神经药理学系 江苏 南京 ）摘要：内质网是蛋白质合成和加工的场所，是细胞“最大的工厂”。作为细胞内最主要的Ca+库，内质网还参与了各种细胞信号的处理。由此可见内质网是细胞内最重要的细胞器之一，内质网功能的紊乱对于细胞来说致死性的，特别是蛋白质合成旺盛的细胞类型，如腺细胞和神经元。内质网的正常的生理功能与细胞内Ca+以及氧化还原状态密切相关，而细胞内Ca+和局部的氧化还原状态亦是交互影响的，任何一个条件的改变均能导致内质网结构或功能的异常，即内质网病理，主要的特征是内质网应激反应（ER Stress Response）的启动
2、。内质网应激是细胞重要的防御机制，原核生物和真核生物均存在而且相似，进化上非常保守。氧化应激也是细胞信号转导系统和重要的防御机制，与内质网应激有着千丝万缕的联系，两者均对整个细胞的生理及病理有重要的“贡献”。关键词：内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）； 粗面内质网（rough ER） 滑面内质网（smooth ER）； 钙库操纵型通道 (Store Operated Channel, SOC) ； ryanodine 受体 (RYR)； InsP3受体 (InsP3R)； Ca+引起的Ca+释放（CICR） ； 伴侣蛋白（chapero
3、ne）； 钙网织蛋白（calreticulin）； 钙联接蛋白（calnexin）； GRP78/BiP； 肌浆（内质）网Ca+-ATP酶（SERCA）； NADPH氧化酶（NADPH oxidase）； 未折叠蛋白反应（unfolded-protein response, UPR）； 内质网相关性降解（ER associated degradation, ERAD）； 内质网过载反应（ER overload response, EOR）； PERK（PKR-like ER kinase;）； Ire（inositol regulating）； ATF（activating transcrip
4、tion factor）； CHOP（C/EBP homologous protein）； Nrf-2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）； bZIP （basic-leucine zipper）； ARE（antioxidant response element）； ERSE（ER stress response element）； UPRE（unfolded protein response element）内质网是细胞内最大的膜网络结构，其两个主要功能是：1.合成、加工蛋白参与代谢；2.细胞信号处理。内质网按照膜结构上是否有颗粒状核糖
5、体分为粗面（rER）和滑面内质网（sER）。滑面内质网仅在肝细胞，分泌固醇类激素的细胞以及肌细胞（肌浆网）等少数细胞大量存在。滑面内质网内的酶主要参与合成脂肪酸和磷脂；在肝细胞这些酶还参与生物转化，将药物、化合物、致癌物等转化为水溶性化合物；而肌细胞的肌浆网主要功能是Ca+浓集。所有真核细胞内都有或多或少的粗面内质网，膜的胞浆面黏附了大量的核糖体。粗面内质网协调膜表面和腔内的蛋白合成，最终将这些蛋白运输到细胞内和细胞外的功能部位。浆细胞的功能是产生抗体，粗面内质网功能发达，整个细胞都充满了粗面内质网。由于具有蛋白质合成和运输的功能，粗面内质网被称为分泌途径的第一个“车间”，对此途径的精确控制的
6、关键就在于前期内质网对蛋白的加工。控制分泌途径的酶可以修饰新生蛋白的特殊氨基酸残基，是其定向运输的必要条件。这些加工步骤包括新生肽链的折叠以及翻译后修饰，比如糖基化或二硫键形成。内质网不仅仅是蛋白质合成的场所，还精确控制蛋白运输过程，因为只有正确折叠和装配好的蛋白亚基才能从内质网转运到高尔基体。错误折叠的蛋白会滞留在内质网内引发特殊的信号通路增强内质网蛋白处理能力或引起细胞凋亡。一 氧化还原状态影响内质网的功能正常情况下内质网的氧化还原电位要高于胞浆，也就是说相对于胞浆，内质网内环境较为氧化。因为内质网内的氧化物为新生肽链的半胱氨酸残基向分子内二硫键转变提供氧化动力。内质网内很多酶比如ERO1
7、的基因产物可以提供氧化动力1。所以内质网内蛋白质的氧化与ROS的生成有关。氧化还原状态的改变以及ROS的存在也影响了内质网上的通道功能和伴侣蛋白的缓冲而影响到Ca2平衡。而且氧化应激和内质网应激都可以激活下游信号使得蛋白质折叠功能恢复或细胞死亡。所以氧化还原稳态是内质网正常功能所必需的。二 内质网是细胞最主要的Ca+库正常情况下内内质网Ca+比胞浆Ca+高数千倍，内质网Ca+依细胞类型不同约在100M800M之间2，3，4，Ca+在两者之间不停的交换，而内质网又有很强的Ca+缓冲能力，是名副其实的“钙库”。内质网腔Ca+的改变可以影响蛋白的合成，而未折叠蛋白的聚集又会破坏内质网的Ca2平衡，这
8、两者中任何一者的改变又影响了氧化还原状态。Ca+是细胞内最重要的离子形态信号分子，作为“钙库”内质网参与了细胞信号的处理。在细胞信号转导过程中，内质网可以接收并传递信号。输入信号有：Ca2，IP3， S-1-P(鞘氨醇1磷酸)，ROS和固醇；内质网产生的输出信号有：Ca2，钙库操纵型通道（SOC）的激活，应激信号，花生四烯酸以及多种转录因子（NF-kappaB，CHOP，ATF6，SREBPs）5。正因为Ca+平衡是维持细胞正常功能的基础，内质网Ca+受到精确的控制。A. 钙释放通道调节内质网Ca+存在两种钙释放通道，ryanodine受体(RYRs)和InsP3受体(InsP3Rs)，它们对
9、胞内各种信号输入敏感。最重要的调节信号就是Ca+本身，Ca+可以通过激活RYRs和InsP3Rs引起Ca+的释放(CICR) 5。CICR将电压依赖（VOCs）和受体依赖(ROCs)的细胞膜钙通道与内质网的内钙释放联系起来，在心肌和神经元上这种联系尤为重要。CICR还能将内钙释放引起的钙波变化在细胞间传递6。可兴奋性细胞的兴奋性依赖于钙动员的第二信使，如三磷酸肌醇(InsP3)和环ADP核糖(cADPR)。另一个决定细胞兴奋的因素是内质网腔Ca+7。当内质网Ca+内流增加到一定水平，超过了缓冲系统的能力，腔内的Ca+就会升高。有很多证据表明内质网Ca+直接影响到RYRs的开放效率。内质网Ca+
10、对RyRs有门控作用是因为RyRs的腔内侧有很多钙感受器三种蛋白复合物triadin-1, junctin, 和 calsequestrin8,9。非兴奋细胞中InsP3Rs参与钙振荡的产生10。内质网Ca+可以影响InsP3Rs引发的内钙释放已经有很多报导，但内质网Ca+是否可以直接调节InsP3Rs还有很多异议。但是可以明确的是内质网Ca+与InsP3引发的内Ca+释放之间存在联系，提示钙库的填充状态可以调节InsP3Rs介导的内Ca+释放7.11。B. 钙结合蛋白调节内质网Ca+内质网内的钙结合蛋白可以分为伴侣蛋白和缓冲分子，两者的定义没有明确的分界。缓冲分子如集钙蛋白（calseque
11、strin）、钙网织蛋白（ calreticulin）具有极强的钙结合能力，对于维持内质网生理Ca+至关重要。钙敏感性伴侣蛋白，如GRP78 (BiP), GRP94 (endoplasmin), calnexin（钙联接蛋白）, GRP170/ORP150以及ERp57，含有多重Ca+结合位点，与Ca+的结合可以调节它们的活性。这些伴侣蛋白在蛋白质合成的量控制中发挥了重要的作用，可以作为蛋白质合成稳态破坏时的防卫系统7。内质网内非折叠蛋白的聚集造成了内质网应激，引发了非折叠蛋白反应（UPR）或内质网超载反应上调伴侣蛋白13,14,15,16。凝集素（lectin）样伴侣蛋白钙网织蛋白(cal
12、reticulin)和钙联接蛋白（calnexin）（形成了calnexin/calreticulin循环）可以辅助折叠很多糖基化的分泌性和膜结构蛋白17,18。这些伴侣蛋白的功能是钙依赖性的，它们与糖蛋白的结合能力受内质网Ca+的影响。Calreticulin与其他两种伴侣蛋白PDI（蛋白质二硫键异构酶）和ERp57的相互作用也是受内质网Ca+调节的17。事实上，内质网Ca+低于50M时伴侣蛋白的功能就被完全抑制，而内质网Ca+平衡紊乱本身就可引起内质网应激，影响到细胞的存活19。CSERCA调节内质网Ca+虽然Ca+信号是由Ca+释放引起的，而Ca+的再摄取，维持钙库的稳定Ca+也是钙信号
13、的重要组成部分。Ca+内集主要由内质网膜上的钙泵 （SERCA）介导20,21。SERCA有三种亚型（1-3）。有足够的证据支持内质网Ca+可以控制SERCA的钙内集作用。研究表明，内质网内高浓度的Ca+可以抑制Ca+的重摄取22。后续的研究还表明SERCA介导的Ca+内集仅受腔内面因素调节23,24。但SERCA是一个Ca+-ATP酶，胞浆内Ca+对SERCA介导的钙内集也有动态调控作用，可能的解释是刺激引起的胞浆内的Ca+超载亦升高了内质网Ca+。还有研究表明SERCA还受内质网伴侣蛋白calnexin，calreticulin和 ERp57的调节，这些伴侣蛋白均可以抑制钙的重摄取。ERp
14、57促SERCA 2b亚基L4段形成二硫键而灭活了钙泵，保证了内质网高Ca+时有效地抑制钙泵。相反，内质网内Ca+下降时calreticulin和ERp57的复合体从SERCA 2b亚基上解离下来，钙泵又恢复了活力7.25.26。内质网Ca+下降可能会引起内质网应激信号通路异常，因此细胞还存在感受库存Ca+充填状态的细胞膜Ca+内流系统来维持内质网恒定的Ca+ 27。这种钙内流机制也称为容量性钙内流（CCE）。当钙库已满，从钙库操纵型通道（SOCs）内流的Ca+减少，而当钙库的Ca+刚开始下降时此通道即开放，介导Ca+内流，始终维持钙库的稳定Ca+浓度。这种Ca+内流机制介导了长期刺激致增殖时
15、的长期Ca+信号。有证据表明内质网上有一小片特殊区域可调节胞膜上的Ca+内流。胞膜上受体的激活使PLC膜定位，产生InsP3，促内质网腔Ca+释放。内质网Ca+下降后能产生信号到胞膜的SOCs介导Ca+内流28，但是仍不清楚这种信号到底是什么，现在有几种假说：Ca+内流因子的生成，包含SOCs的小泡的胞吐作用，内质网的Ca+释放通道与SOCs有构相联系28。三Ca+与蛋白质合成Ca+平衡对于蛋白质的合成也是至关重要的。除网织红细胞，哺乳动物体内所有细胞的蛋白质合成的维持需要Ca+的平衡。内质网Ca+支持蛋白质的早期加工，磷酸化翻译起始因子2（eIF2）调节蛋白合成速率29。内质网Ca+耗竭时糖
16、蛋白高度甘露糖化。在UDP-葡萄糖葡萄糖基转移酶（UGGT）的作用下形成“糖标识”30。随后糖蛋白与calnexin, calreticulin和PDI样酶形成复合物，使得糖蛋白滞留于内质网内31。当Ca+重充填内质网时“糖标识”被移除，复合体解离，糖蛋白才能被正确折叠并被转运出内质网。而Ca+是如何参与非糖基化蛋白的折叠、亚基组装或翻译、转运却鲜为人知。推测Ca+可能通过中和或暂时交联富含谷氨酸或天冬氨酸区域的羧基来辅助新生肽链的折叠29。Ca+还可以促进亚基组装或特异的蛋白酶解加工。高Ca+水平是内质网蛋白折叠系统必须的。腔内高Ca+是蛋白翻译、转运、折叠时伴侣蛋白和肽链形成联系必须的29
17、。内质网Ca+也参与控制蛋白翻译速率。内质网Ca+的耗竭可以抑制氨基酸的掺入，单核糖体和核糖体亚基代替了多核糖体，胞内43S起始复合物减少，eIF2磷酸化并且eIF2B受抑制。耗竭内质网Ca+库的因素有InsP3，EGTA和其他鳌合剂，毒胡萝卜素（抑制了SERCA）调节Ca+从内质网膜到细胞膜的因素如Ca+离子载体inomycin和A23187，不饱和脂肪酸如花生四烯酸29。除毒胡萝卜素是内质网Ca+聚集的不可逆抑制物，其他因子的作用可随着胞内Ca+水平的升高在几分钟内被逆转。四 ROS和内质网Ca+氧化还原信号通路的中心是特定蛋白氧化还原敏感位点的氧化还原变化。静息状态下，细胞内环境是高度还
18、原态的，而局部氧化电位的升高是细胞重要功能的触发点5。不管何种源性氧化应激引起的ROS水平的升高都会造成外Ca+内流和内Ca+释放。胞浆内Ca+升高使得向核和线粒体内流的Ca+增多。核内的Ca+水平可以调控基因的转录水平以及核酸酶的活性。而不管是在核内还是在胞浆，Ca+均能控制蛋白的磷酸化和去磷酸化，从而达到信号转导调节的目的。线粒体Ca+负荷则加速了线粒体的代谢，而线粒体代谢的增加又促进了ROS的生成。线粒体内ROS生成增多启动了一系列下游事件，包括促进了内质网的Ca+释放32。ROS选择性氧化修饰内质网钙调节蛋白的特定位点是其影响内质网Ca+信号的重要机制。内质网内环境比胞浆氧化程度更高可
19、能是某些位于内质网的蛋白的氧化所必需的33。SERCA巯基的氧化24及ATP结合位点酪氨酸的硝化35均可抑制其活性。而且羟自由基可以直接攻击其ATP结合位点34，导致ATP依赖的钙内集作用减弱和ATP消耗下降。内质网内Ca+耗竭又会抑制蛋白的合成和加工，使得未折叠蛋白聚集。而未折叠蛋白的聚集又会引起内质网伴侣蛋白的基因如GRP78/BiP, GRP94和calreticulin的表达上调，增强钙库功能防止细胞钙毒性。这些现象表明氧化应激可以抑制SERCA功能而增加细胞内Ca+水平。而另一方面内质网ATP消耗减少使线粒体ATP生成减少，而线粒体代谢水平下降又会减少ROS的生成。所以线粒体ATP合
20、成减少提供的还原当量是重要的细胞抗氧化机制和细胞修复机制，以此降低氧化分子的聚集。最近的研究发现ROS可以稳定未折叠的SERCA 2a和calreticulin形成的复合体，导致了SERCA长时性抑制和SERCA 2a亚基的降解36。如前所述SERCA 2b的活性受内质网腔内的氧化还原酶ERp57调节，而这种调节作用是依赖于内质网内Ca+和氧化还原状态的。当内质网腔内转为还原态时，在ERp57的作用下SERCA 2b的巯基被还原显示了高活性，使得内质网内Ca+升高。最近又有报道表明硫氧还蛋白家族成员ERp44可以特异性结合InsP3受体1的L3V区段的半胱氨酸残基，直接抑制了由InsP3受体介
21、导的内Ca+释放37。所以在内质网腔内环境较为还原时，SERCA 2b和InsP3受体协同作用，升高内质网Ca+。腔内较为还原时不利于蛋白质的折叠，而许多伴侣蛋白和氧化还原酶需要较高的Ca+。已经证实ERp44与Ero1之间形成的分子间二硫键是造成Ero1腔内滞留的原因38。而Ero1家族蛋白在氧化态蛋白的折叠处理中起了关键性的作用，所以ERp44对蛋白折叠的作用可能是双重的：通过灭活InsP3受体1抑制内Ca+释放（增强了Ca+依赖的伴侣蛋白的作用）和通过与Ero1形成二硫键增强了Ero1/氧化还原酶系统。而非折叠蛋白反应可以诱导ERp44的表达上调正好可以说明这一点37。也有证据支持ROS
22、影响内质网的Ca+释放。内皮细胞上氧化态的谷胱甘肽和ROS源性的黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶可以促进InsP3受体介导的钙库的内Ca+释放。另外，在血管平滑肌，过氧化物也可以促InsP3受体介导的Ca+释放39。肌浆网上的ryanodine敏感性Ca+通道也受ROS的调节40，可能是几个关键性巯基可以被氧化修饰。而且已经找到证据支持RyR是局部氧化还原电位敏感的41。氧化还原反应在Ca+释放的动力学控制中起了关键性的作用。ROS可能是调节Ca+转运体活性的氧化还原信号分子42。温和的氧化应激使得细胞内氧化还原电位轻微升高可以显著增强RyR的活性，敏化了Ca+释放机制。还有研究表明ROS通过对cADPR
23、的作用影响了心肌肌浆网的Ca+释放，参与了细胞的Ca+活动。ROS对Ca+的双向调节作用可能是浓度依赖性的。低浓度时（纳摩尔水平），ROS促进cADPR的合成，协同钙调蛋白一起开放了RyR。而高浓度时（毫摩尔水平），ROS抑制了钙调蛋白活性，进而抑制了RyR 43。除线粒体外还细胞内有其他ROS的产源。在吞噬性细胞，NADPH氧化酶（含膜结合催化亚基和胞浆侧调节亚基）可以产生大量的过氧化物44。非吞噬性细胞也表达NADPH氧化酶的许多亚型，各亚型都含主要的催化亚基gp91phox（NOX2），其产生的ROS主要参与细胞信号转导45,46。粒细胞上NOX2表达于细胞膜，非吞噬细胞也表达NOX亚型
24、47。还有研究表明内质网内中有NOX亚型，并且和calnexin及calreticulin共存49。虽然内质网NOX表达的意义还未明确，但最近的研究提示NOX1和NOX4可以与PDI作用，即线粒体之外的ROS也可能调节内质网功能。内质网内NADPH氧化酶的激活可以使钙库对InsP3信号更加敏感49，可能源于NADPH氧化酶的ROS敏化了InsP3受体进而影响了钙振荡。7-酮胆甾醇可以活化含NOX4亚基的NADPH氧化酶，使得ROS生成增多并影响到钙振荡。钙平衡的紊乱诱发内质网应激，IRE-1激活诱导促凋亡因子CHOP以及伴侣蛋白GRP78/BiP的表达,标志了未折叠蛋白反应（UPR）的激活50
25、。还有研究认为肌浆网内NADPH氧化酶可以增强RyR活性51。五 内质网病理（内质网应激）氧化还原状态的改变、Ca+平衡的紊乱均影响到内质网正常的生理功能，而内质网功能紊乱是细胞致死性的，因此细胞进化了强大的自我保护机制内质网应激反应（ESR），最大限度地对抗内外源性的应激。内质网应激是由于未折叠或错误折叠的蛋白质累积或内环境的Ca+浓度的改变导致了内质网结构和功能的失衡引起的。此时内质网的反应以特定蛋白质的改变为特征：翻译速率的下调，内质网伴侣蛋白的表达上调，错误折叠蛋白质的降解。通常情况下，这一系列反应（ESR）能成功恢复内质网的内环境平衡。不过，在多细胞动物里，持久或者强烈内质网应激也会
26、引发程序性细胞死亡或凋亡52。 引发内质网应激反应（ESR）的因素有：未折叠或错误折叠蛋白过度等蓄集；内质网类脂或醛酯类的失衡；或者内质网腔内的氧化还原或离子的环境方面的变化所形成的紊乱；糖剥夺也可引发ESR，是由于蛋白N-端糖基化受影响53,54。ESR既要增加内质网的折叠能力又要处理损伤的蛋白质，并且通过降低在内质网里面的蛋白质的数量来减轻细胞器的负担。这些效应主要通过三条通路来完成52：(I)一种高度保守的未折叠蛋白反应(UPR)，它依靠上调内质网伴侣蛋白和其他分泌器官的成分来增强内质网的多肽折叠能力和加工能力；(II) 蛋白酶体依赖的内质网相关性降解（ERAD）可以将过多的蛋白从内质网
27、中移除； (III) 调节蛋白翻译速率，减少进入内质网的蛋白总量。这三条通路几乎是同时进行并交叉的，而没有时间上的承接。UPR的最初目的是适应环境的改变，恢复内质网正常功能。参与这种适应的机制包括：蛋白折叠相关基因的表达上调，促进错误折叠蛋白的内质网相关性降解（ERAD）。最初几个小时内mRNA的翻译受抑制，直到编码UPR相关蛋白的mRNA转录出来。若适应阶段未能恢复正常的内质网功能则以NF-B的激活为标志的警戒信号启动。NF-B的下游基因产物介导宿主的主动防御此通路又称为内质网过载反应（EOR）。过强或长期的ESR诱导细胞“自杀”，一般是凋亡的形式55。内质网应激的适应阶段：恢复内环境稳态当
28、内质网腔内未折叠形态的蛋白聚集时，固有的伴侣蛋白从内质网膜蛋白的腔面解离下来主动结合到未折叠蛋白。与伴侣蛋白的分离使得内质网膜蛋白激活，启动UPR。这些跨内质网膜的蛋白一般是N-端向腔内，C-端向胞浆。正常情况下这些蛋白的N-端结合了内质网伴侣蛋白Grp78(BiP)，阻止了蛋白之间的聚集。当异常折叠蛋白堆积，Grp78解离下来，这些跨膜蛋白之间聚集活化，启动UPR。其中最重要的三种内质网跨膜蛋白是PERK，Ire1，ATF6 56,57,58。A） PERKPERK（PKR样内质网激酶）是丝/苏氨酸蛋白激酶，其催化区与真核起始因子2（eIF2）家族具同源性。PERK属于eIF2激酶家族，此家
29、族成员还有GCN2，PKR，HRI。PERK是UPR中控制蛋白翻译的中心。Grp78解离，PERK寡聚化并自我磷酸化，显示了激酶活性。PERK磷酸化抑制eIF2，广泛下调了mRNA翻译速率，减轻了内质网的蛋白载量。但是有一些特殊的mRNA（5-非翻译区含upstream ORF）却可以在此情况下优先翻译，典型的例子是ATF4。ATF4蛋白是bZIP转录因子家族成员，调节UPR相关基因表达。ATF4可以结合ATF/CRE元件(特征序列5-TGACGTCA-3)和AARE(核心序列5-TGACGTCA-3) 59。ATF4可诱导的重要蛋白之一是CHOP。CHOP是含169个氨基酸残基（啮齿类动物1
30、68）的蛋白质，是CAAT/增强子结合蛋白（C/EBPs）的成员，是C/EBPs的负性抑制物。CHOP蛋白含两个功能区，N-端转录激活区和C-端DNA结合区含bZIP（亮氨酸拉链）序列。CHOP还含两个相邻的丝氨酸残基（79和82），可以作为P38 MAPK家族的底物。CHOP可以形成同二聚体和异二聚体（与其他C/EBPs），但更倾向于形成异二聚体。CHOP异二聚体不能结合C/EBP位点即5-(A/G)TTGCG(C/T)AA(C/T)-3但是可以另外的唯一结合位点5-(A/G) (A/G)(A/G)TGCAAT(A/C)CCC-3而调控目的基因的表达59。因此CHOP的功能是双重的，即C/E
31、BPs的功能抑制物和其他基因的激活物。CHOP广泛表达但是非应激下表达量很低。应激可以诱导CHOP的表达和核内聚集。CHOP是多能的，介导了特异的凋亡途径，涉及细胞生长和分化的选择性死亡以及各种疾病中细胞的病理死亡。最近有研究表明PERK可以激活Nrf2 60。PERK/Nrf2通路的发现提示了内质网应激和氧化应激之间的协同作用。Nrf2属于bZIP转录因子的CNC家族，此家族成员还有NF-E2，Nrf1-3和Bach1-2。NF-E2只表达于红细胞，调节珠蛋白基因的表达61。而E相关因子（Nrf）蛋白(Nrf1-3)则广泛表达，可以感受氧化应激并作出应答62。CNC家族转录因子单体并不能上调
32、目的基因的表达，其作用有赖于与其他bZIP转录因子形成的异二聚体，通常是sMaf蛋白成员。Keap1-Nrf2-ARE通路。在非应激细胞，Nrf2与Bric-a-Brac, Tramtrack ,Broad Complex (BTB) 蛋白Keap1形成胞浆复合物。此复合物的形成抑制了Nrf2的活性并介导了其泛素化降解。氧化应激以及内质网应激等可诱导Nrf2/ Keap1复合物的解离，Nrf2则入核启动目的基因表达。Nrf2结合的基因特征是启动子区含ARE（抗氧化调节元件）序列，效应是：直接提供抗氧化物; 编码灭活氧化物的酶系; 促进GSH的合成及再循环; 促进NAPDH的合成; 增强MRT(
33、multidrug response transporter)的活性加速毒物的外排; 抑制细胞因子介导的炎性反应; 增强蛋白修复及降解系统的功能。Nrf2-/-小鼠对肝、肺、神经性毒物及药物、炎症刺激和致癌物高度敏感64。研究表明UPR中Nrf2的激活和核移位依赖于PERK的激活，但是不依赖于ROS以及eIF2的磷酸化，提示Nrf2是PERK的底物63。而Nrf2-/-小鼠对内质网应激诱导物高度敏感直接支持这一结论，Keap1-Nrf2-ARE参与了UPR63。PERK的激活在内质网应激中处于中心地位，PERK基因敲除细胞对内质网应激高度敏感，而PERK敲除小鼠表现出各种严重缺陷，比如体型小、
34、骨发育异常和一型糖尿病。而应激时翻译速率的下调是细胞保护性的，有研究表明应激时特异性eIF2磷酸化抑制物促细胞凋亡。图1. UPR中的PERK信号通路。内质网应激反应中，PERK被激活，磷酸化抑制了eIF2，磷酸化激活了Nrf2。eIF2的磷酸化导致广泛翻译速率下调但ATF4、CHOP的翻译反而被激活。Nrf2磷酸化激活后入核，目的基因表达，恢复氧化还原平衡。B) Ire1与PERK类似，Grp78的解离亦促进了内质网膜蛋白Ire1的寡聚化。Ire1是一型跨膜蛋白，有、两种亚型，含丝/苏氨酸激酶区和核酸内切酶区。因此Ire1可以剪切X-BOX蛋白-1(XBP-1)mRNA的含26个核苷酸的内含
35、子，使其成为成熟mRNA，赋予其翻译能力，产物为41kDa的XBP-1蛋白，也是bZIP家族转录因子。XBP-1蛋白与NF-Y二聚化后显示转录激活活性，结合至少两种顺式元件内质网增强子（ERSE）和未折叠蛋白反应元件（UPRE）65，特征序列5-TGACGTGG-3。XBP-1上调的基因产物包含了逆向转运错误折叠蛋白的转运体以及UPR相关蛋白。Ire1敲除小鼠在胚胎发育期即死亡66，提示该蛋白的重要生理意义。B） ATF6(p)ATF6(p)的N-端Grp78的分离引发了其相独特的激活方式。Grp78非结合的ATF6(p)暴露出高尔基体定位信号（GLS）移位到高尔基体，在高尔基体Site-1/
36、2蛋白酶的水解作用下释放出N-端胞浆区具转录活性的ATF6(N)，ATF6(N)随即入核发挥转录激活活性。转录因子ATF6(N)含有bZIP模序，与NF-Y形成的同源或异源三聚体可结合ERSE67，核心序列5-CCAAT-N9-CCACG-3。 ATF6与Ire1信号有协同作用，因为ATF6(N)可以上调XBP-1 mRNA的转录水平。警戒信号：内质网过载病毒感染时诱导大量糖蛋白产生导致内质网负载过重，内质网应激表现出固有免疫相关信号的激活。在此信号中Ire1处于中心地位，表现出TNF受体活性，结合接头蛋白TRAF2。TRAF2是一种E3连接酶，可以结合Ubc13，诱导非典型63赖氨酸而不是典
37、型48赖氨酸的多聚泛素化68。TRAF2激活系列炎症免疫相关激酶，其中最重要的激酶是Ask1，形成了Ire1/TFAR2/ASK1复合体69，级联激活JNK以及NF-B。此复合体的形成还募集了c-Jun-N-端抑制性激酶（JIK）结合到Ire1。内质网应激的最终形态：诱导凋亡适应信号 、警戒信号都致力于恢复内质网的蛋白处理能力和氧化还原平衡及Ca+平衡，支持细胞渡过应激期。而当内质网损伤变为不可逆，不能恢复正常功能时凋亡信号即被启动。内质网应激诱导的凋亡表现为多种途径，既包括经典的线粒体凋亡途径，又包括特异的caspase12途径，而高表达bcl-2等抗凋亡蛋白可以结抗内质网应激引起的凋亡。c
38、aspase12caspase分为起始caspase和效应caspase。大部分caspase位于胞浆，而鼠类内质网膜上存在caspase12，推测其特殊定位可以直接感受内质网内环境稳态的失衡。Ire1的活化提供支架募集pro-caspase12，并酶解激活为caspase12，caspase12是起始caspase，级联激活经典的效应caspase，如caspase3。由于caspase12的酶解激活很难检测到70，内质网应激中caspase12是如何被激活的还有争议。也有研究者认为caspase12的活化是间接的，涉及Ca+的释放引起calpains的激活71。还有观点认为caspase7
39、由胞浆移位到内质网参与了caspase12的激活72。缺乏caspase12基因的小鼠对内质网应激诱导物如tunicamycin，thapsigargin高度不敏感。但是人类的caspase12基因发生了无意义突变73，因此内质网应激诱导caspase12活化的凋亡途径受到质疑。但是有学者认为人类的caspase4是与啮齿类caspase12的类似物，可能替代了caspase12的部分功能与内质网应激相关74。但是caspase4属于细胞因子诱导的致炎性caspase而非致凋亡caspase。Caspase4表达下调的人神经母细胞瘤能部分对抗内质网应激诱导物以及A蛋白引起的细胞凋亡，但不能对抗
40、线粒体死亡途径。而HeLa细胞下调caspase4表达后对内质网应激诱导物仍敏感，提示caspase4介导的内质网应激源性细胞凋亡是组织特异性的。图2 内质网应激的适应、警戒与凋亡。内质网应激主要由内质网膜上的三种蛋白介导PERK, ATF6, Ire1介导。非应激环境下，这三种蛋白的腔内端与GRP78/BiP结合处于活性抑制状态；当应激产生时，GRP78/BiP与这三种蛋白分离，使得蛋白腔内端同体二聚化自我激活，从而产生级联反应，增强蛋白处理能力，促细胞存活。当应激过强或过久就会启动死亡程序。内质网应激诱导的凋亡主要涉及caspase家族, CHOP, bcl-2家族以及Ca+毒性等多条途径
41、。Bap31Bap31定位于内质网膜，推测含三个穿膜区和亮氨酸拉链以及类死亡效应子（DED-L）区，此区可能募集胞浆caspase8的某亚型。根据胞浆区尾部是否被caspase降解，Bap31可表现出促凋亡和抗凋亡双重作用75,76。过表达全长Bap31可以抑制死亡受体Fas介导的凋亡途径；而20-kDa剪切形态的Bap31是促凋亡的，介导了内质网Ca+的释放。ASKASK与TNF受体家族介导的死亡途径有关。内质网应激中，Ire1募集TRAF2，激活ASK1，级联激活JNK和p38MAPK。Ask1-/-神经元对内质网应激诱导物不敏感提示了ASK1及JNK的活化在此调亡途径中起了重要作用77。
42、虽然ASK1的下游仍未明确，但至少有证据表明JNK可以介导促凋亡蛋白Bim的磷酸化激活78。综合以上，Ire1在ESR的适应阶段（XBP-1），过载阶段（TRAF-NF-B），凋亡阶段（ASK1,caspase12）均起了重要作用。CHOP CHOP是bZIP转录因子C/EBP家族成员，内质网应激诱导CHOP的高表达。Chop基因的启动子区可以结合大部分UPR特征性转录因子，包括ATF4，ATF6和XBP-1 59。CHOP-/-小鼠对tunicamycin引发的肾损伤，以及对大脑动脉阻塞引起的脑缺血均不敏感；自发高血糖Akita小鼠的CHOP基因缺陷能显著延迟胰腺岛细胞的凋亡102；CHOP
43、基因敲除可以保护帕金森造模药6-OHDA引发的神经原死亡103。所有证据提示内质网应激时CHOP有细胞损伤作用79。但是CHOP如何促凋亡的还未完全清楚。CHOP与C/EBP家族其他成员形成异二聚体，抑制它们结合C/EBP位点，但此二聚体有特殊的CHOP结合位点。CHOP的目的基因可能包含bcl-2，CHOP可以下调bcl-2的表达80。最新的研究主张CHOP诱导GADD34的表达，促进GADD34/PP1复合体的形成，此复合体与PERK的作用相反使磷酸化的eIF2alpha脱磷酸，应激条件下恢复蛋白翻译水平造成内质网超载是致死信号104。CHOP可能还有非转录激活活性，但是还没有确切的证据。
44、有一点可以肯定的是CHOP并不是内质网应激诱导凋亡所必需的。Bcl-2蛋白家族和其调节物类似线粒体，Bcl-2/Bax蛋白家族亦存在于内质网膜，调节内质网Ca+平衡，控制内质网应激诱导物以及过氧化物导致的细胞死亡81。Spike是锚定在内质网膜上的BH3-only蛋白成员，其BH3样区是诱导凋亡必需的82，但是还没有发现与Bcl-2/Bax家族成员形成的二聚体。抗凋亡蛋白Mcl-1以及促凋亡蛋白Bik主要位于内质网83,84。最近的研究表明至少一种Bcl-2/Bax家族成员由内质网应激诱导BH3only蛋白Puma。tunicamycin和thapsigargin诱导Puma的表达而不依赖于p
45、53。Puma-/-细胞对内质网应激诱导的凋亡不敏感85。Ca+多种因素如低氧、氧化物、InsP3诱导物以及SERCA抑制剂可以促内质网Ca+耗竭，参与细胞死亡。Ca+参与的细胞死亡机制繁多55，至少包括（a）增加线粒体通透性，Ca+大量进入线粒体基质，引起线粒体Ca+超载;（b）激活内质网附近的calpain，它是一种半胱氨酸蛋白酶，参与了细胞病理性死亡，作用底物有Bax和Bid（激活）;Bcl-2和Bcl-xL(抑制);（c）改变了Ca+依赖的正常的膜磷脂结构如磷脂酰丝氨酸外翻，破坏了膜的生理功能，导致细胞凋亡或坏死；（d）Ca+/CaM激活蛋白磷酸酶calcineurin，介导Bad的去
46、磷酸化，去磷酸化的Bad结抗结合Bcl-xL；介导NFAT家族转录因子的去磷酸化激活，入核激活促凋亡基因FasL的表达；（e）激活了Ca+敏感的NO合酶亚型；（f）激活了死亡相关蛋白激酶（DAP kinase）和其受体DRP-1。总之，细胞Ca+超载可以以及其多样化的形式促细胞凋亡或坏死。内质网应激诱导的凋亡过程涉及细胞内Ca+超载，是由于内质网膜上的蛋白对Ca+库的调节作用以及Ca+的渗漏。六 内质网应激与疾病内质网应激参与多种疾病的进程，是一种泛在的病因机制。但内质网应激对疾病所起的作用到底是什么还不能肯定，但应该与疾病的种类、严重程度以及病程长短直接相关。A）神经退形性疾病（NDD）帕金
47、森氏病（PD）PD是渐行性神经退行性疾病，表现为黑质纹状体中多巴胺能神经元的进行性死亡，神经元胞浆内包涵体Lewy小体（含-synuclein）增多。PD的病因还未明确，但公认的机制有兴奋性毒性和能量代谢紊乱、氧化应激、线粒体活性下降以及UPS功能紊乱。环境因素比如杀虫剂和其他因素也可以诱发散发性PD，而散发性在全部病例占了90%以上。最近研究表明，至少疾病的发生与内质网应激和蛋白降解系统有关。而少见的家族性PD有较明确的相关基因的突变87，其编码的白是-synuclein，Parkin，DJ-1，PNK1，UCHL-1（素C末端水解酶-1）以及最近被克隆的LRRK2/dardarin，所有这些突变基因的最终损伤效应汇聚到蛋白质处理能力的异常。表明内质网应激与PD有关的证据来源于离体细胞培养以及在体造模药物，如6-OHDA，MPTP或其活性衍生物，MPP+等，这些复合物均能引内质网应激并诱导一些特征